【摘 要】
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目的:观察四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）模型大鼠的治疗效果,通过研究Notch信号通路介导机体Treg/Th17细胞失衡,探讨温肾健脾法及其代表方四神丸治疗脾肾阳虚型UC的作用机制。方法:120只SPF级SD大鼠（雌雄各半）,随机选取100只采用病证结合模型的方法（番泻叶灌胃+氢化可的松注射液皮下注射+2,4-二硝基苯磺酸（2,4-Dinitroben
【基金项目】
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国家自然科学基金（NO.8196150427）:从伏邪角度探讨温肾健脾法通过肠道菌群调控 Treg/Th17 细胞失衡治疗溃疡性结肠炎的免疫机制；
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目的:观察四神丸对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）模型大鼠的治疗效果,通过研究Notch信号通路介导机体Treg/Th17细胞失衡,探讨温肾健脾法及其代表方四神丸治疗脾肾阳虚型UC的作用机制。方法:120只SPF级SD大鼠（雌雄各半）,随机选取100只采用病证结合模型的方法（番泻叶灌胃+氢化可的松注射液皮下注射+2,4-二硝基苯磺酸（2,4-Dinitrobenzenesulfonic acid,DNBS）/乙醇溶液灌肠）,建立脾肾阳虚型UC大鼠模型,剩余20只作为空白组。将成模大鼠随机分为模型组、阳性药物（美沙拉秦）组、四神丸低、中、高剂量组。治疗21天后取材,观察大鼠一般情况,主要包括大便性状、活动度、饮食量、皮毛光泽和精神状态等方面;苏木精-伊红染色法镜下观察各组大鼠结肠组织的病理改变。采用流式细胞术和酶联免疫吸附测定法检测Treg、Th17细胞及其相关细胞因子IL-10和IL-17的水平。采用免疫组织化学法、蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合反应检测大鼠结肠组织中Treg、Th17细胞转录因子Foxp3、RORγt蛋白与m RNA的表达,Notch信号通路中配受体Jagged1、Notch1蛋白与m RNA的表达。结果:1造模组大鼠在造模过程中,随着造模的进程逐渐表现出饮食减少、体重明显减轻、精神萎靡、反应迟钝、活动度降低、扎堆明显、皮毛晦暗杂乱无光泽、脓血便等情况;苏木精-伊红染色结果显示大鼠结肠损伤严重,腺体结构破坏,可见大量的炎性细胞;结肠组织损伤评分显示,相较于空白组,模型组大鼠损伤评分显著增加（P＜0.01）;上述情况符合脾肾阳虚型UC模型大鼠的特点,表明模型建立成功。2流式细胞结果显示,相较于空白组,模型组大鼠外周血Th17细胞占比显著升高（P＜0.01）,Treg细胞占比显著降低（P＜0.01）;与模型组相比,阳性药物组及四神丸低、中、高剂量组大鼠外周血Th17细胞的占比均显著降低（P＜0.01）,阳性药物组及四神丸高剂量组大鼠Treg细胞占比显著升高（P＜0.01）。酶联免疫吸附测定数据显示,相较于空白组大鼠,模型组IL-10含量显著降低（P＜0.01）,IL-17含量显著增加（P＜0.01）;与模型组相比,阳性药物组及四神丸中、高剂量组大鼠结肠组织IL-10含量显著升高（P＜0.05）,阳性药物组及四神丸低、中、高剂量组大鼠结肠组织IL-17含量显著降低（P＜0.01）。3免疫组织化学法和蛋白质印迹法结果显示,与空白组相比,模型组大鼠结肠组织Jagged1、Notch1、RORγt蛋白的表达显著升高（P＜0.01）,Foxp3蛋白的表达显著下降（P＜0.01）;与模型组相比,阳性药物组与四神丸中、高剂量组大鼠结肠组织中Jagged1、Notch1、RORγt蛋白的表达显著下降（P＜0.01）,Foxp3蛋白的表达显著增加（P＜0.01）。4荧光定量聚合反应结果显示,相较于空白组,模型组RORγt、Notch1以及Jagged1m RNA表达显著升高（P＜0.01）,Foxp3 m RNA表达水平明显降低（P＜0.01）;与模型组相比,阳性药物组、四神丸高剂量组Jagged1、Notch1、RORγt m RNA的表达量显著降低（P＜0.01）,Foxp3 m RNA的表达量显著升高（P＜0.01）。结论:1温肾健脾法及其代表方四神丸能下调UC大鼠外周血中Th17细胞的比例,结肠组织中IL-17的含量与转录因子RORγt蛋白及m RNA的表达量;上调UC大鼠外周血中Treg细胞的比例,结肠组织中IL-10的含量与转录因子Foxp3蛋白及m RNA的表达量;纠正Treg/Th17细胞失衡,进而抑制炎症,发挥治疗UC的作用。2温肾健脾法及其代表方四神丸能下调UC模型大鼠结肠组织中Notch1、Jagged1蛋白及m RNA的表达量;可能是通过有效纠正Notch信号通路介导的Treg/Th17细胞失衡,来发挥治疗脾肾阳虚型UC的作用。
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