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肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是多种致病因子引起慢性肝病,进而发展为肝硬化的共有病理改变和必经途径,如能阻断、减轻乃至逆转肝纤维化,就能在很大程度上改善肝病的预后,因而这一课题也引起了国内外学者的广泛关注。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)活化、增殖、迁移进而合成大量的胶原等细胞外间质(extracellular matrix, ECM)成分是肝纤维化形成的中心环节。因此,抑制HSCs活化、迁移、增殖或诱导其凋亡是逆转肝纤维化的关键所在。细胞迁移是机体正常生长发育以及组织损伤、修复和炎症反应必不可缺的病理生理过程,在肝组织损伤及肝纤维化形成过程中,损伤局部大量HSCs聚集可能与HSCs的定向迁移有关,在此过程中又受到一系列复杂的细胞因子的网络调节。黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是整合素信号通路的关键信号分子,多项研究表明其在成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及多种肿瘤细胞的黏附、迁移中发挥关键作用,但对HSCs黏附、迁移的影响知之甚少。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是目前最有效的基因沉默技术,能特异性抑制靶基因的转录,进而下调相应蛋白水平及功能。为此,我们采用RNAi技术,从HSCs迁移入手,以FAK为切入点,构建了靶向FAK的RNAi序列,在阳离子聚合物介导下将干扰质粒瞬时转染HSCs,研究特异性阻断FAK表达对纤维连接蛋白(fibronectin, FN)刺激的HSCs黏附、迁移的影响及其机制。实验内容包括以下两部分:第一部分:靶向FAK特异性RNA干扰重组体的构建及筛选目的:利用pEGFP质粒构建靶向FAK的短发卡RNA(shRNA)干扰重组体,并通过转染HSCs筛选有效的干扰序列。方法:利用在线设计软件,分别设计两对针对FAK的有小发卡结构的两条DNA序列及一对非特异对照序列,经退火成互补双链,再克隆至带有U6启动子及增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的质粒pEGFP中,构建重组体,转化大肠杆菌(DH5α)菌株,提取质粒进行酶切鉴定后,进行测序分析。体外培养HSCs,并以FN刺激HSCs增殖,在阳离子聚合物梭华-SofastTM介导下,将构建成功的3组重组体转染大鼠肝星状细胞系HSC-T6。采用荧光显微镜及流式细胞仪分析转染效果;通过real-time Q-PCR技术检测各组FAK mRNA变化,Western blot技术检测FAK蛋白表达情况,筛选出有效抑制FAK表达的序列。实验分6组:①空白对照组(简写为Con);②FN刺激组(简写为FN组);③转染试剂组(简写为Sofast组);④pEGFP-HK shRNA组(简写为HK组);⑤pEGFP-FAK shRNA1组(简写为shRNA1组);⑥pEGFP-FAK shRNA2组(简写为shRNA2组)。②～⑥组中FN浓度均为10μg·mL-1。结果:①酶切测序分析结果表明已成功构建了能表达FAK shRNA的两组重组体pEGFP-FAK shRNA及通用阴性对照pEGFP-HK shRNA;②转染后48 h,利用荧光显微镜及流式细胞仪证实转染成功,转染效率约40%;③shRNA下调FAK mRNA的表达:real-time Q-PCR结果显示,FN组,Sofast组及HK组之间无明显差异,shRNA1组和shRNA2组mRNA均有降低,其中shRNA1组下调率为52.98%,shRNA2下调率为76.82%;④shRNA抑制FAK蛋白表达:Western blot分析,在125 kD位置出现FAK杂交带,光密度值结果显示,shRNA可显著下调FAK蛋白的表达,shRNA1转染后48 h蛋白下调率为51.50%,shRNA2转染后48 h蛋白下调率为72.53%,故选取shRNA2进行后续实验。结论:利用含U6启动子及EGFP的质粒载体pEGFP可成功构建FAK的shRNA干扰重组体,且可成功转染入HSCs,其中shRNA2对FAK的抑制效率较高。第二部分:FAK shRNA干扰重组体抑制肝星状细胞黏附与迁移及其机制目的:应用FAK shRNA质粒转染HSCs,探讨特异性阻断FAK表达对FN介导的HSCs黏附和迁移的影响。方法:应用体外细胞培养技术,采用甲苯胺蓝染色法了解shRNA对HSCs黏附的抑制情况;采用伤口愈合实验以及改良的Boyden双腔系统了解FAK shRNA对HSCs平面迁移和跨膜迁移的抑制作用;采用real-time Q-PCR技术检测FAK、ERK1 mRNA水平变化,Western blot技术检测转染前后FAK、p-FAK、ERK1及p-ERK蛋白表达情况。结果:①FAK shRNA抑制FAK mRNA表达:real-time Q-PCR结果显示shRNA可显著下调FAK mRNA的表达,且对FAK mRNA的下调从干扰后12 h即出现,最高下调率出现在干扰后24 h,为70.51%,但瞬时转染对FAK mRNA的下调持续时间较短,48 h后mRNA水平有所回升;②FAK shRNA抑制FAK表达及活化:Western blot结果显示,shRNA可显著下调FAK蛋白的表达,但出现蛋白下调的时间晚于mRNA,干扰后24 h FAK蛋白表达开始下调,最高下调率出现在干扰后48 h,为71.81%,干扰后72 h蛋白表达有所回升;p-FAK(Tyr397)蛋白表达亦表现出同样的变化:FN组中p-FAK蛋白含量较对照组升高37.89%;但FN组、Sofast组与HK组之间比较无明显差异;shRNA转染48 h后,p-FAK(Tyr397)蛋白表达较HK组显著降低,下调率为62.71%,经统计学处理有显著性差异,说明FAK shRNA干预HSCs可明显抑制FAK磷酸化;③FAK shRNA抑制ERK1表达及活化:real-time Q-PCR结果显示,干扰后24 h,FN组ERK1 mRNA表达较对照组增强70.27%,而FN组、Sofast组与HK组之间无明显差异;FAK shRNA干扰组ERK1 mRNA表达较HK组明显下降,最高下调率为55.67%,出现在干扰后48 h。Western blot显示FN刺激后HSCs ERK1蛋白表达量较对照组上调77.55%,但与Sofast组、HK组比较无明显差异,FAK shRNA质粒转染HSCs 48 h后,ERK1蛋白表达量显著降低,较HK组下降了65.13%。同时,p-ERK的变化也表现出相似的趋势,其最高下调率为75.47%,出现在干扰后72 h。④FAK shRNA抑制HSCs黏附:根据以上结果,选取蛋白下调率最高的时间点,即干扰后48 h进行HSCs黏附和迁移的检测。应用FN包被培养板,与Con组相比,FN组HSCs黏附率增加了35.68%,FN组、Sofast组、HK组之间无明显差异,FAK shRNA转染48 h后,细胞黏附率较HK组降低58.69%,有统计学意义。⑤FAK抑制HSCs迁移:伤口愈合实验表明,FN刺激后,细胞迁移距离较Con组增加63.00%,FN组、Sofast组、HK组之间无明显差异,shRNA组细胞迁移距离较HK组减低58.27%,有统计学意义。细胞跨膜迁移结果分析显示:FN组细胞迁移数较对照组增加82.25%,差异有显著性,FN组、Sofast组、HK组之间无明显差异,FAK shRNA转染组跨膜细胞数较HK组显著下降,其抑制率为83.70%。说明FAK shRNA可抑制HSCs的平面和跨膜迁移能力。结论:FN可有效诱导HSCs的黏附和迁移,并刺激FAK、ERK1的表达和活化,在阳离子聚合物介导下瞬时转染靶向FAK的shRNA质粒,可在转录和翻译水平下调FAK表达,伴随FAK活性的下降,ERK1的表达亦表现出相似的变化,同时HSCs的黏附和迁移能力明显受到抑制。