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微生物降解植物甾醇侧链可制备得到雄烯二酮（AD）等重要甾体药物中间体。从AD出发,可以合成几乎所有的甾体激素类药物。然而,该过程中存在着甾醇底物低水溶性、产物抑制和降解等技术难题,限制了这一生物转化法的反应效率。离子液体作为一种新型的绿色溶剂,由于其独特的理化性质近年来在生物催化与转化中的应用报道层出不穷,但在微生物降解植物甾醇侧链过程中的相关研究还刚刚起步。离子液体的生物毒性和生物可降解性也是影响该过程转化效率和工业化生产的重要因素,因此由天然无毒材料如胆碱、氨基酸、羧酸等组成的新型离子液体更具竞争力。本文将胆碱氨基酸离子液体作为共溶剂应用于分枝杆菌Mycobacterium sp.MB 3683降解植物甾醇侧链生产AD过程中,结合其他过程强化策略以提高AD的产量,并探究离子液体共溶剂体系中全细胞转化过程的作用机制,推动离子液体绿色工艺的发展。首先,合成了 18种由胆碱阳离子和氨基酸阴离子构成的新型亲水性离子液体,系统评价了其用于植物甾醇生物转化的溶剂特性,探讨了影响植物甾醇生物转化效率的关键因素。离子液体的密度稍大于水,黏度较高,但加入少量水后黏度迅速下降。大多数离子液体的疏水性参数logP小于-2,可作为共溶剂使用,其随氨基酸阴离子侧链类型从大到小的变化顺序为:长链烷基＞短链烷基＞极性基团。离子液体对疏水性底物植物甾醇和产物AD有着优异的溶解性能,且与其极性成反比。离子液体对分枝杆菌细胞具有良好的生物相容性,其中3种离子液体[Ch][Asp]、[Ch][Glu]和[Ch][Gln]在高浓度下依然展现出极低的细胞毒性。AD的累积速率受植物甾醇在离子液体共溶剂中的溶解度和细胞的生物相容性共同影响,随离子液体的浓度增加先上升后下降,通常在1 vol.%离子液体体系中可得到高的AD初始生产速率。考虑长时间的植物甾醇生物转化过程,离子液体的生物相容性尤为重要,3种具有较好生物相容性的共溶剂体系[Ch][Asp]、[Ch][Glu]和[Ch][Gln]均能有效解除产物降解途径,提高AD的产量。其中,在1 vol.%[Ch][Asp]体系中转化30h的AD产量是缓冲液体系的2倍左右。其次,研究了胆碱氨基酸离子液体共溶剂体系中晶胶微球固定化分枝杆菌细胞降解植物甾醇侧链生产AD的过程。通过调节亲水聚合单体甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA）和疏水聚合单体甲基丙烯酸正丁酯（BMA）的比例,利用滴加冷冻聚合法制备得到了 7种不同疏水性的晶胶微球。随着晶胶微球疏水性的增加,分枝杆菌更倾向于聚集分布在微球的表面,微球内部的细胞量明显减少且更为分散。其中半疏水（HEMA/BMA=1:1）晶胶微球固定化细胞在微球内外分布相对均匀和分散,有效地缓解了疏水分枝杆菌细胞易团聚问题,单位细胞的AD产量是悬浮细胞的近13倍。生物相容离子液体[Ch][Asp]和[Ch][Glu]共溶剂体系同样能有效解除固定化分枝杆菌细胞中产物AD的降解途径,在1 vol.%[Ch][Asp]体系中,固定化细胞转化36h的AD产量可达0.37 g/L,是缓冲液中的1.5倍。固定化细胞在多次循环后催化活力损失明显,但其有着良好的储存稳定性,在储存20天后细胞催化活性依然在80%以上。此外,将大孔吸附树脂作为原位产物吸附剂与胆碱氨基酸离子液体共溶剂体系中分枝杆菌降解植物甾醇侧链生产AD的过程相耦合,起到促进底物溶解、解除产物抑制和降解的作用。选取了 7种代表性的非/弱极性大孔吸附树脂,其中HZ-818树脂具有较好的AD吸附性能和生物相容性,且对AD具有高选择性,在添加20 g/LHZ-818树脂后缓冲液中分枝杆菌静息细胞转化24 h的AD产量可达1.01 g/L,相比无树脂体系提高了 181%。随后对离子液体共溶剂体系中耦合树脂吸附转化过程进行了优化,在1 vol.%[Ch][Glu]体系中添加20 g/L HZ-818树脂后分枝杆菌静息细胞转化36 h的AD产量为1.86 g/L,而在5 vol.%[Ch][Glu]体系中于发酵60h时添加20 g/L HZ-818树脂发酵120h的AD产量可达2.08 g/L。HZ-818树脂对于植物甾醇生物转化过程具有良好的重复利用性,连续使用5次仍能有效促进AD的生产。最后,结合分子生物学实验和分子动力学模拟手段研究了胆碱氨基酸离子液体对分枝杆菌中甾醇侧链降解几个关键酶的影响。从分枝杆菌全基因组中定位了2个编码胆固醇氧化酶（ChO）的基因chO1和chO2,1个编码3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）的基因hsd,3个编码3-甾酮-9α-羟基化酶（KSH）的基因kshA1、kshA2和kshB，以及1个编码3-甾酮-Δ1-脱氢酶（KstD）的基因kstD。甾醇脱氢酶ChO1和ChO2因其活性位点上方灵活的疏水环结构,在低浓度（0-1 vol.%）离子液体存在时活性基本不受影响,而另一种甾醇脱氢酶3β-HSD暴露在外的催化区域使其相比于ChO更易受到离子液体的影响。KshA1和KshA2活性口袋附近带负电,易吸引离子液体中的胆碱阳离子,破坏蛋白的底物结合通道结构;KstD活性口袋附近带正电,易吸引离子液体中的氨基酸阴离子,改变底物与活性位点的相对位置,使得催化活性降低。添加离子液体后上述AD甾核降解酶的部分α-螺旋结构逐渐转变为无规卷曲结构,荧光光谱显示离子液体与AD甾核降解酶的Trp残基间存在相互作用并降低了蛋白的稳定性。因此AD甾核降解酶KshA1B、KshA2B和KstD对离子液体的耐受性较差,在低浓度（0-1 vol.%）离子液体存在时催化性能就会被明显抑制。相比于[Ch][Glu]而言,[Ch][Asp]对KshA1、KshA2和KstD活性和结构的破坏更为严重,可能与其较高的电离度有关,其解离的阴阳离子与蛋白残基的相互作用较强。对上述甾醇侧链降解关键酶在离子液体共溶剂体系中活性和结构的解析,验证了[Ch][Glu]和[Ch][Asp]对分枝杆菌AD降解途径的抑制作用,阐明了两种离子液体在植物甾醇生物转化过程中的作用机制。综上所述,绿色无毒的胆碱氨基酸离子液体可作为共溶剂应用于植物甾醇侧链降解过程,与其他强化策略发挥协同作用以提高过程转化效率,在甾体药物生物转化上具有广阔的应用前景。对含离子液体体系中全细胞生物转化的机制探讨,可为离子液体的设计及开发提供更多理论指导,推动生物催化与转化过程的可持续发展。