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人血管抑素(angiostatin ANG)是血浆纤维蛋白溶酶原(plasminogen Pgn)中一个38KD的片段，属内生性蛋白质，包含Pgn的前4个三环域(Kringle区)。它能特异地抑制血管内皮细胞的生长。每个Kringle约有80个氨基酸构成。它在人体内有二种生成途径：①某些肿瘤细胞分泌的蛋白酶降解纤维蛋白溶酶原而产生；②由某些金属弹性蛋白酶(如巨噬细胞衍生的金属弹性蛋白酶)降解纤维蛋白溶酶原而生成。正常人血浆中的浓度维持在1.6±0.2μmol／L。 体内外实验证实，ANG具有很强的抑制血管生成的能力，在控制肿瘤生长和转移方面有广阔的应用前景。目前，通过体外酶解纤溶酶原方法可以获得一定量的活性ANG，但由于其成本高、操作复杂，远远不能满足临床需要。本实验以人纤溶酶原的cDNA为模板，成功地将ANG相应的93-470位氨基酸的核苷酸克隆到pSP 71载体上，，并进行了序列分析和体外表达，为下一步通过转基因盐藻生产ANG奠定了基础。 方法与结果 1、肝脏总RNA的制备：从5例成人正常肝脏组织中按照Trizol试剂盒说明进行总RNA的提取，然后通过紫外分光光度仪和甲醛变性凝胶电泳检测所提RNA的纯度和完整性。结果显示其纯度和完整性均达到实验要求。 2、人ANG基因的扩增：以总RNA为模板，以随机引物六聚体为引物，通过RT-PCR合成cDNA。参照文献设计人ANG(含XhoI和EcoRI酶切位点)及β-actin引物，以合成的cDNA为模板用Pfu DNA聚合酶进行扩增，得到1141bp和245bp基因片段。 3、克隆载体pSP-hANG的构建：纯化的hANG PCR产物和载体pSP71分别经XhoI和EcoRI双酶切、连接，构建载体pSP-hANG。酶切鉴定hANG基因已克隆到载体pSP71郑州大学2004届硕士学位论文人血管抑素基因的克隆、序列分析和体外表达上。 4、重组质粒测序和序列分析:以T7和SP6为测序引物，采用双脱氧末端终止法对酶切鉴定正确的克隆载体进行测序，用DNA分析软件序列分析发现，中国人ANG上有3个碱基发生了突变。即第825位上的C被T替换、第927位上的T被G替换及第1078位上的G被A替换。前2个虽然碱基突变，但相应的氨基酸Cys257和Val291没有变化，但第3个突变位点的氨基酸va1342变成了Met342。 5、表达载体pRSET一hANG的构建及其诱导表达:将pRSET(b)和pSP一hANG分别用Ihol十EcoR工双酶切，回收酶切片段pRSET(b)和hANG，连接，构建载体pRSET一hANG。PRsET--hANG经工PTG诱导后进行SDS一PAGE，在约42KD处出现一条特异带。 6、体外表达pRSET一hANG:将pRSET一hANG线性化，利用体外表达试剂盒在试管内将目的基因进行体外转录和体外翻译。 7、体外表达产物的检测:将体外表达产物进行 SDS一PAGE、western Blot，用化学发光方法检测到阳性信号。结论 1、克隆得到中国人ANG基因片段，其碱基和氨基酸的变化可能是人群中该基因的遗传多态现象。 2、体外表达系统是一种高效、快速、易于重复的蛋白表达系统。 3、化学发光检测是一种安全、方便、非常有效的蛋白表达检测方法。