背景与目的当肿瘤细胞作为一个细胞群集体(多细胞球球体)存在时,其产生的耐药现象称之为“多细胞耐药或群集耐药(MCR)”。多细胞耐药或群集耐药的产生有赖于体内实体瘤三维立体的空间结构,可以通过建立体外三维培养模型被很好的模拟出来。这种培养方式更接近体内实体瘤情况,与普通单层培养方式相比,其化疗敏感性低。通过Kerbel实验小组对三维立体细胞培养模型的革新发现:当肿瘤细胞以三维培养方式存在时,多细胞球球体可产生内源性抵抗化疗药物及放射治疗的作用。我们也同样的证实了许多肿瘤细胞系(如肺癌、结肠癌、胃癌等),在体外三维培养方式下形成的多细胞球球体细胞后,其化疗药物作用后肿瘤细胞半数死亡药物浓度(IC50)要比普通平面培养方式高很多。多细胞耐药或群集耐药主要关注的是以细胞信号转导网络为基础的“细胞—细胞”或“细胞—基质”相互作用以及他们特殊的微环境。其中比较重要的是,当多细胞球球体形成后,细胞分泌多种细胞—细胞和细胞—基质粘附分子,如E-钙粘附素和整合素家族分子。这些存在着大量的细胞与细胞、细胞与基质粘附分子,可以介导肿瘤细胞生存以及对化疗药物的抵抗。当细胞粘附分子被阻断后,其粘附分子介导的耐药性可以逆转或消失。在粘附分子抑制剂当中,抗整合素抗体包括抗αv亚单位抗体和抗β1亚单位抗体可以抑制细胞—基质相互作用、介导细胞凋亡以及逆转多细胞耐药性。Semaphorin3F是一种跨膜蛋白分子,介导神经轴突锚定、细胞生长、迁移和血管形成的信号转导。最近的研究发现,在内皮细胞中,Sema3F可以下调整合素αvβ3的活性。因此,我们设想,Sema3F是否可以通过下调肿瘤细胞整合素αvβ3从而逆转多细胞耐药性,进一步找到一种逆转肿瘤多细胞耐药性可行的策略。方法1.建立结肠癌多细胞耐药体外三维培养模型,并观察其与普通平面培养模型在生物学特性上的改变,检测结肠癌细胞系中Sema3F表达差异,选择合适细胞系。2.应用RT-PCR、免疫组化、激光共聚焦方法,观察细胞粘附分子整合素αvβ3在结肠癌细胞多细胞耐药体外模型的表达,并比较其与普通平面培养表达的差异。通过整合素αvβ3抗体阻断粘附分子整合素αvβ3表达,观察结肠癌细胞群集耐药性的情况。3.应用MTT和Radial outgrowth方法,检测和比较三维球型培养条件下稳定转染Sema3F基因前后,结肠癌HT29细胞化疗敏感性的情况,以及Sema3F对整合素αvβ3的作用。结果1.成功建立结肠癌细胞多细胞三维培养模型(图1),扫描电镜和透射电镜显示,多细胞球球体直径在1.0-2.0mm不等;可见桥粒和粘着小带等细胞紧密连接(图2,图3)。结肠癌HT-29、LoVo细胞中Sema3F mRNA(图17)和蛋白(图18)表达较低。2.整合素αvβ3 mRNA(图8)及蛋白(图9,图10),在三维球型较普通平面培养相比表达明显增高;球型细胞与普通平面细胞相比,对化疗药物更加耐药;整合素αvβ3抗体阻断整合素αvβ3后,可提高多细胞球球体对化疗药物的敏感性(图7)。3.建立稳定转染Sema3F的结肠癌HT29细胞三维培养模型。不同浓度5-FU(0,125,250,500,1000,2000μg/ml)作用HT29细胞48h后,MTT法(图24)及Radialoutgrowth assay(图25),流式细胞检测(图4,5,13)以及克隆形成试验(图26)检测稳定转染Sema3F多细胞球球体与对照组相比较,转染后的细胞三维球型化疗敏感性明显增加。检测转染Sema3F后细胞以及空转对照以及HT29细胞整合素αvβ3蛋白表达水平发现,转染Sema3F的结肠癌HT29细胞可以下调整合素αvβ3蛋白表达。结论1.结肠癌细胞多细胞耐药体外模型与普通平面培养细胞相比结构更加紧密;多细胞球球体对化疗药物的敏感性与普通平面培养细胞相比,其药物敏感性显著降低。2.结肠癌HT29细胞多细胞球球体与普通平面培养细胞相比,粘附分子整合素αvβ3 mRNA及蛋白表达显著增高;整合素αvβ3抗体阻断结肠癌HT29细胞多细胞球球体整合素αvβ3表达可以提高对化疗药物的化疗敏感性。3.Sema3F可下调结肠癌HT29细胞整合素αvβ3表达,可以提高结肠癌HT29细胞的化疗敏感性。