性别决定和性腺分化是鱼类生殖过程的重要部分，也是保证其生存和进化的一个基本过程。dax1基因是孤儿核受体的一员，在性别决定和分化中有着重要的作用。本研究首先克隆了鲆鲽鱼-牙鲆(Paralichthys olivaceus)dax1全长cDNA及5’侧翼区序列，研究了该基因在成鱼各组织的特异表达，进一步采用实时定量PCR技术分析了该基因在早期胚胎发育以及性腺分化发育过程中的表达，并研究了该基因启动子区CpG岛的甲基化状态。同时在体外对该基因进行了原核重组表达。　　 首先，本研究采用RT-PCR以及RACE等方法从牙鲆性腺组织中克隆出牙鲆dax1基因的全长cDNA序列(Genebank accession No.HQ380020)。分析结果表明，牙鲆dax1 cDNA序列全长1446bp，包括5’非翻译区219bp，3’非翻译区330bp，开放阅读框897 bp，编码298个氨基酸残基，理论蛋白分子量为33.08 kDa。该cDNA序列具有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA和Poly(A)。牙鲆Dax1的DNA结合域DBD缺乏典型的锌指结构，与其他非哺乳类动物Dax1蛋白类似，牙鲆Dax1只有一个保守的LXXLL基序，而没有NR盒1和NR盒2。序列相似性比对发现，牙鲆dax1与其他鱼类dax1相似性最高，继而是鸟类、爬行类和哺乳类。　　 利用基因组步移的方法，获得了牙鲆dax1转录起始位点前2Kb的基因组序列，并识别出可能的启动子序列。用MatInspector等软件对牙鲆dax15’侧翼序列的转录因子结合位点进行预测，进一步对牙鲆和其他脊椎动物的dax15’侧翼序列的保守功能模块和网络进行了分析。结果表明，牙鲆dax15’侧翼区存在sf1、wt1、TCF/LEF、oct3/4等保守的转录因子结合位点。　　 组织特异性表达结果显示，dax1基因在牙鲆成体大多数组织中都可以检测到，性腺、脾脏和脑表达量相对较高，而肝脏和肌肉的表达量相对较低。在两性性腺中均可以检测到该基因的表达，但是存在比较明显的两性表达差异，在卵巢中的表达强于精巢。Real-time PCR结果显示，该基因在牙鲆胚胎发育早期就可以检测到表达，但各发育阶段表达量不同。该基因在二倍体对照牙鲆、雌核发育及雌核发育性反转牙鲆性腺分化开始前(全长约2cm)表达量迅速升高，达到最大值，在性腺分化开始时表达最降低。同时，该基因在不同性腺发育时期的表达量也有差异。整体来说，dax1在牙鲆各期卵巢中的表达量都高于相应时期精巢中的表达量。其中，Ⅰ期雌雄性腺中表达量相近，Ⅱ期精巢和卵巢中表达量都有所上升，之后在Ⅲ期在精巢和卵巢都有所下降，但卵巢表达量依旧略高于精巢，到Ⅳ期表达再次上升，尤其是卵巢的表达量上升较明显，Ⅴ期表达量比Ⅳ期略有下降。　　 甲基化表观遗传修饰水平研究结果显示，牙鲆dax1基因调控区的14个CpG位点的甲基化水平均较低，不存在明显的两性差异。卵巢中的甲基化水平为1.4％(2/140)，精巢中的甲基化水平为2.1％(3/140)。雌核发育牙鲆卵巢及雌核发育性反转牙鲆的精巢dax1基因调控区CpG位点甲基化水平也没有明显的两性差异，前者2.1％(3/140)的CpG位点发生了甲基化，后者中也仅有2.8％(4/140)的CpG位点发生了甲基化，。　　 将牙鲆dax1基因编码区序列插入到表达质粒pProEXTMHTa上，在大肠杆菌Transetta(DE3)中对Dax1蛋白进行体外重组表达原核表达。获得的重组蛋白存在于宿主菌中，不是分泌型蛋白，大部分的Dax1重组蛋白以包涵体形式出现。在37℃的培养条件下，重组蛋白的最佳IPTG诱导时间为4 h，最佳诱导浓度为1 mmol/L。