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器官移植是解决终末期器官衰竭最有效的治疗方案之一,移植物的存活与否是判断器官移植成功的首要条件。然而,移植排斥反应是影响移植物存活并导致移植失败的根本原因。移植排斥反应的发生主要由受体T细胞对移植物抗原的特异性识别,进而诱发强烈的免疫应答。而具有负向调控作用的调节性T细胞（Regulatory T cell,Treg）,作为一类重要的CD4+T细胞亚群,在抑制移植排斥反应方面发挥着重要的调节作用。其中,转录因子FoxP3的稳定表达对Treg细胞的发育及功能至关重要。因此,Treg细胞在不同环境中所介导的免疫调节作用与受多种机制影响的Foxp3基因的表达直接相关。据报道,表观遗传调控是基因组与环境之间相互作用并影响基因表达的重要调控形式。其中,腺苷酸第6位N原子上发生的甲基化修饰（N6-methyladenosine,m~6A）是真核生物m RNA上最丰富的转录后修饰。近期的研究结果表明,m~6A修饰可通过调控Treg细胞的发育分化影响自身免疫性疾病的发生及进展。然而,m~6A修饰是否参与移植环境中Treg细胞功能继而介导移植排斥反应的发生,还未见报道。本课题旨在探讨m~6A修饰对移植后Treg细胞功能的重要作用,并揭示该过程的具体分子机制。主要研究内容如下:1.磁珠分选技术分离来源于胰岛移植耐受模型（Allograft Tolerance Treg,AT-Treg）及胰岛移植排斥模型（Allograft Rejected Tregs,AR-Treg）的Treg细胞。通过dot-blot、western blot以及q RT-PCR实验分析发现,与AT-Treg细胞相比,AR-Treg细胞中m~6A修饰水平及相关甲基转移酶的表达均明显下降。随后,通过Cre-Loxp系统构建Treg细胞特异性缺失Mettl14的条件性敲减小鼠(FoxP3-Mettl14f/+cKO,cKO),随即对其进行胰岛移植。结果发现,与同窝对照小鼠（Ctrl）相比,cKO小鼠的胰岛移植物完全失去对血糖的调控,并导致移植排斥反应的发生。2.在移植术后7天,通过免疫荧光及流式细胞术评估了移植物及次级淋巴器官中Treg细胞的比例。结果发现,与Ctrl小鼠相比,移植后cKO小鼠的Treg细胞在脾脏及引流淋巴结中显著下调。同时,Treg细胞在移植物周围的比例也明显减少。随后,我们分析了Ctrl及cKO小鼠次级淋巴器官中TH细胞的比例,结果发现cKO小鼠的反应性TH1及TH17细胞的比例明显增加,同时移植物被大量炎症性T细胞浸润。这些结果提示了,Mettl14的缺失可能影响了Treg细胞的抑制性功能,继而加重移植后的炎症反应并导致移植排斥的发生。此外,抑炎细胞因子IL-10及TGF-β是功能性Treg细胞的标志物,通过ELISA实验发现Mettl14缺失干预了IL-10及TGF-β的表达。更重要的是,我们通过体内回输实验及体外T细胞增殖实验分别证明了Mettl14缺失破坏移植后Treg细胞的效应功能。3.分别取移植术后7天,Ctrl及cKO小鼠的Treg细胞并进行RNA-seq及Me RIP-seq测序分析,结果发现Sema4D是Mettl14介导FoxP3表达的潜在靶点。根据IGV及Me RIP-q PCR实验发现,Mettl14介导的m~6A修饰可直接调控Sema4d m RNA的3’UTR区域。随后,基于m RNA衰减实验及荧光素报告质粒实验揭示了m~6A-Mettl14-YTHDF2分子轴调控Sema4d m RNA的稳定性。同时,根据western blot实验表明,Mettl14缺失促进了Sema4D的表达并抑制下游p-PAK、p-STAT5及p-JAK的激活,最终影响FoxP3的表达及Treg细胞的功能。综上所述,本研究从表观遗传的角度揭示了Mettl14介导的m~6A修饰通过影响FoxP3的表达,调控移植后Treg细胞功能,继而影响移植排斥反应的机制研究。该研究不仅为移植术后维持Treg细胞功能提供新策略,还为Sema4D可能作为预测移植排斥反应的生物标志物提供理论依据。