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目的: 1.观察苗药金乌健骨方总提物对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)增殖的抑制作用;2.观察苗药金乌健骨方总提物对RA-FLS炎症因子IL-6、TGF-β、IL-17分泌的影响;3.通过观察金乌健骨方总提物对RA滑膜细胞IL-23R、IL-17R受体和相关细胞因子RORα、RORγt、STAT3、pSTAT3基因和蛋白表达水平的影响,探讨金乌健骨方总提物对RA滑膜细胞IL-23/IL-17炎 症轴的作用机制。 方法: 1.金乌健骨方总提物的提取醇提法制备金乌健骨方总提物,提取相当于生药浓度10mg/mL的母液,稀释成0.01mg/mL、0.03mg/mL、0.06mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、3.0mg/mL、6.0mg/mL的混悬液,共分为9组。2.选用3-5代RA-FLS为研究对象,分别给予不同浓度苗药金乌健骨方总提物(共9组)、来氟米特、雷公藤多苷、无血清培养基处理24h。采用MTT法检测不同浓度金乌健骨方总提物对RA-FLS增殖的抑制作用。酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中IL-6、TGF-β、IL-17的浓度,聚合酶链式反应(PCR)检测各组细胞IL-23R、IL-17R、RORα、RORγt、STAT3mRNA的基因表达,蛋白印迹法(western blot)检测各组细胞总蛋白中STAT3、pSTAT3、IL-17R的蛋白活性。 结果: 1.MTT检测金乌健骨方总提物对RA-FLS的抑制作用空白对照组RA-FLS持续增殖;在金乌健骨方总提物干预24h后,与空白对照组比较,随着药物浓度的增加,OD值逐渐下降,抑制率逐渐上升。2.ELISA检测金乌健骨方总提物对RA-FLS培养上清液中IL-6、TGF-β、IL-17分泌的影响加药干预24h后,与空白对照组比较,各组细胞培养上清液中IL-6、TGF-β、IL-17的浓度均有不同程度的降低,具有明显统计学差异(P<0.01)。不同浓度的金乌健骨方总提物均可下调IL-6、TGF-β、IL-17的分泌,高剂量组作用强于低、中剂量组,差异具有明显统计学意义(P<0.01)。与雷公藤多苷对照组比较,金乌健骨方总提物高剂量组IL-6、TGF-β、IL-17的分泌降低(P<0.01);而中剂量组与雷公藤多苷对照组对IL-17的下调作用相当,表达无明显差异(P>0.05)。与来氟米特对照组比较,金乌健骨方总提物高剂量组下调IL-6、TGF-β、IL-17分泌量的作用优于来氟米特组,差异具有显著统计学意义(P<0.01);但低、中剂量组下调IL-6的作用与来氟米特对照组无明显差异(P>0.05)。3.PCR检测金乌健骨方总提物对RA-FLS IL-23R、IL-17R、RORα、RORγt、STAT3mRNA表达的影响加药干预24h后,与空白对照组比较,经不同药物干预后,RA-FLS中IL-23R、IL-17R、RORα、RORγt、STAT3mRNA的表达量均有所下降,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。与雷公藤多苷对照组比较,金乌健骨方总提物中剂量组均可明显下调IL-23R、IL-17R、RORα、RORγt、STAT3mRNA的表达,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),但高剂量组下调作用更优,具有明显统计学差异(P<0.01)。与来氟米特对照组比较,金乌健骨方总提物低剂量组下调RORγt、STAT3、IL-17R mRNA的作用无明显差异(P>0.05),高剂量组对IL-23R、IL-17R、RORα、RORγt、STAT3mRNA的下调作用明显优于来氟米特组,具有明显统计学意义(P<0.01)。4.WB检测金乌健骨方总提物对RA-FLS STAT3、pSTAT3、IL-17R蛋白活性的影响加药干预24h后,与空白对照组比较,不同药物组细胞总蛋白中STAT3、pSTAT3、IL-17R的蛋白表达水平明显下降(P<0.01)。与雷公藤多苷对照组比较,金乌健骨方总提物中剂量组IL-17R的蛋白表达水平无明显差异(P>0.05),高剂量组下调STAT3、pSTAT3、IL-17R蛋白表达的作用更强,具有明显统计学差异(P<0.01)。与来氟米特对照组比较,金乌健骨方总提物高剂量组对STAT3、pSTAT3、IL-17R蛋白的下调作用更显著,差异具有明显统计学意义(P<0.01)。 结论: 1.金乌健骨方总提物对RA-FLS的增殖具有抑制作用。2.金乌健骨方能够下调RA-FLS培养上清液中IL-6、TGF-β、IL-17的分泌,降低细胞内IL-23R、IL-17R、RORα、RORγt、STAT3mRNA的基因表达,抑制细胞中IL-17R、STAT3、pSTAT3蛋白的合成。3.金乌健骨方能够通过下调IL-6、TGF-β的分泌,减少IL-17的生成;同时直接下调滑膜细胞IL-17受体的表达,阻断IL-17对滑膜的侵袭。4.金乌健骨方可能通过抑制滑膜细胞中IL-23受体的表达,减少IL-23R与IL-23的结合,从而抑制STAT3及其磷酸化水平,下调RORα、RORt的表达,最终阻止IL-17的生成。