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研究背景与目的
随着人们生活水平的提高、生活方式和饮食结构的改变，饮酒已经成为大多数人的生活习惯，酒精性肝病（alcoholicliverdisease,ALD）的发病率也迅速增加。近年来，越来越多的研究发现，慢性酒精摄入导致肠道微生态失调，小肠屏障功能受损，通透性增加，导致肠腔内内毒素LPS进入循环系统，加重肝脏损伤及炎症。因此控制炎症是治疗肝脏损伤的关键。大量相关文献报道查尔酮的衍生物L6H21具有明显的抗肿瘤、抗炎、抗有丝分裂、抗菌、治疗心血管和抗高血糖活性等作用。然而L6H21能否保护酒精（EtOH）-LPS诱导的肝损伤及其机制还不清楚。在本研究中，应用C57BL/6小鼠，通过饮食饮用5%酒精10天，之后腹腔注射LPS6小时。L6H21以灌胃方式给予10天。确定EtOH-LPS对肝损伤、肝脂肪变性及炎症的影响，确定L6H21的保护作用及其机制。期待L6H21可能被用来作为治疗酒精性肝病的替代策略。
方法
1.动物实验：
(1)选择成年（8-10周）雄性C57BL/6小鼠，应用Lieber-DeCarli液态饮食法给予酒精，首先给予酒精梯度（1.6%和3.3%EtOH各3天）适应一周后，5%EtOH喂养10天，在最后一天给予LPS腹腔注射6小时诱导肝损伤。L6H21通过灌胃给予10天。根据所给药物的不同，将小鼠分为四组：Control组；EtOH组；EtOH+LPS组；L6H21+EtOH+LPS组。通过H&E染色确定酒精是否引起肝组织学的改变。通过油红O染色和甘油三酯（TG）含量测定检测肝脏脂肪堆积情况。应用试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），以评估肝功能。
(2)通过非特异性酯酶染色液（CAE法）观察中性粒细胞浸润情况。通过F4/80染色检测小鼠肝损伤模型中巨噬细胞浸润情况。
(3)通过免疫荧光染色法确定L6H21对酒精和LPS诱导的肝组织活性氧（ROS）产生的影响。
(4)IκBs/NF-κB复合体相关蛋白（IκBα、p65）的表达水平采用Westernblot法来检测，观察模型中炎症反应及IκBs/NF-κB复合体的解离和激活情况变化。通过Westernblot法检测肝组织中炎症小体相关蛋白（NLRP3）的表达，下游相关调节蛋白（Caspase-1、Casp-1P20）表达变化并用ELISA法测定肝组织匀浆中相关炎症因子（IL-1β、TNF-α）的表达水平，确定L6H21对酒精性肝病模型中炎症小体的影响。
2.细胞实验：
(1)采用小鼠巨噬细胞（Raw264.7细胞）进行体外实验，待细胞在培养瓶底生长的密度达70%后，分组进行实验。将实验分为以下五组：Control组；EtOH组；LPS组；EtOH+LPS组；L6H21+EtOH+LPS组；L6H21组。
(2)采用CCK-8法确定酒精和LPS对Raw264.7细胞活性的影响以及不同浓度L6H21（10uM、20uM）预处理对Raw264.7细胞活性的保护作用；并用TUNEL试剂盒对各组细胞进行免疫荧光染色以检测各组细胞凋亡情况。
(3)分别用DCFH-DA染色、Westernblot法和Caspase-3免疫荧光染色检测不同组别Raw264.7细胞中活性氧产生情况和线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平以及细胞凋亡情况。
(4)采用Westernblot法和免疫荧光染色法检测在不同组别Raw264.7细胞中TLR4-NF-κB通路相关蛋白（TLR、核p65、胞浆p65、GAPDH及Histone）表达的表达水平和NF-κBp65入核情况。
(5)采用Westernblot法研究不同组别Raw264.7细胞中NLRP3炎症小体通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达情况。
结果
1.H&E染色和油红O染色结果表明，与对照组相比，EtOH组肝组织出现脂肪空泡；与EtOH组相比，EtOH+LPS组肝组织脂肪空泡明显增加；而给予L6H21预处理后，脂肪空泡大量减少，减轻了EtOH和LPS诱导的肝脂肪变。肝组织中甘油三酯含量（TG）和血清ALT、AST检测结果表明，与对照组相比，EtOH+LPS组中TG（P＜0.05）和血清ALT（P＜0.05）、AST（P＜0.01）明显增加；与EtOH+LPS组相比，L6H21明显减少了TG（P＜0.05）和血清ALT（P＜0.05）、AST（P＜0.05）水平。
2.CAE染色结果显示，与对照组相比，EtOH组有少量中性粒细胞渗出；与EtOH组相比，EtOH+LPS组发现大量中性粒细胞渗出；而给予L6H21处理后这种炎性细胞渗出明显减少。同时也进行了F4/80免疫荧光染色，与对照组相比，EtOH组肝组织中有少量巨噬细胞浸润，EtOH+LPS组巨噬细胞浸润明显，而给予L6H21处理后，巨噬细胞浸润现象减少。
3.在动物水平，DHE染色结果表明，与对照组相比，EtOH组有少量活性氧产生（P＜0.05）；与EtOH组相比，EtOH+LPS组活性氧水平明显升高（P＜0.05）；而给予L6H21处理之后活性氧水平大幅度降低（P＜0.05）。
4.在动物水平，Westernblot和免疫荧光染色结果表明，与EtOH组相比，EtOH+LPS组TLR4-NF-κB通路的相关蛋白TLR4（P＜0.01）、核p65（P＜0.01）和p-IκB（P＜0.05）表达水平均增加，而IκBα（P＜0.05）表达水平降低；与EtOH+LPS组相比，给予L6H21处理后TLR4-NF-κB通路的相关蛋白TLR4（P＜0.05）、核p65（P＜0.01）和p-IκB（P＜0.05）表达水平明显降低，而IκBα（P＜0.05）表达水平增加。
5.在动物水平，Westernblot结果表明，与EtOH组相比，EtOH+LPS组NLRP3炎症小体通路相关蛋白NLRP3（P＜0.05）和Caspase-1（P＜0.01）表达水平明显上升；而给予L6H21处理后NLRP3通路相关蛋白表达水平有所下降（P＜0.05）。ELISA结果显示，与对照组相比，EtOH+LPS组炎症因子TNF-α（P＜0.01）和IL-1β（P＜0.01）表达水平大幅度上升；而给予L6H21处理后炎症因子TNF-α（P＜0.05）和IL-1β表达水平有所下降（P＜0.05）。
6.在细胞水平，CCK-8实验结果表明，与对照组相比，EtOH组（P＜0.05）和LPS组（P＜0.01）减少了Raw264.7细胞活性；而EtOH+LPS组对细胞活性的损伤作用更明显（P＜0.01）；给予两个浓度的L6H21（10uM、20uM）处理减轻了酒精和LPS对细胞活性的损害，浓度为10uM时效果更明显。接下来的实验选择10uM的L6H21继续进行。TUNEL验结果表明，与对照组相比，EtOH+LPS组细胞凋亡数增多，而给予L6H21处理后细胞凋亡数明显减少。
7.在细胞水平，DCFH-DA检测结果显示，与对照组相比，EtOH组（P＜0.01）和LPS组（P＜0.05）活性氧水平略有上升，而EtOH+LPS组活性氧水平上升明显（P＜0.01）；然而给予L6H21处理后活性氧水平大幅度下降（P＜0.01）。Westernblot结果表明，与对照组相比，EtOH组、LPS组以及EtOH+LPS组线粒体凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达增加，Bcl-2表达减少，其中EtOH+LPS组尤为明显；而给予L6H21处理后Bax和Caspase-3（P＜0.01）表达减少，而Bcl-2表达增加。Caspase-3免疫荧光结果和蛋白结果保持一致。
8.在细胞水平，Westernblot和免疫荧光结果表明，与对照组相比，EtOH组、LPS组以及EtOH+LPS组TLR4-NF-κB通路相关蛋白TLR4、胞核p65表达增加，胞浆p65蛋白水平下降，NF-κBp65入核；而L6H21显著抑制TLR4-NF-κB通路激活。
9.在细胞水平，Westernblot实验结果表明，与对照组相比，EtOH组、LPS组以及EtOH+LPS组NLRP3通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达水平均上升，且在EtOH+LPS组更为明显。给予L6H21预处理后，NLRP3通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达水平均下降。
结论
1.酒精-LPS明显诱导了诱导C57BL/6小鼠肝损伤和脂肪变性。
2.在体内外实验结果表明，酒精-LPS诱导的肝损伤与激活活性氧、线粒体损伤以及TLR4-NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活相关。
3.L6H21通过抑制ROS产生、TLR4-NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活，改善了酒精和LPS诱导的肝损伤。
随着人们生活水平的提高、生活方式和饮食结构的改变，饮酒已经成为大多数人的生活习惯，酒精性肝病（alcoholicliverdisease,ALD）的发病率也迅速增加。近年来，越来越多的研究发现，慢性酒精摄入导致肠道微生态失调，小肠屏障功能受损，通透性增加，导致肠腔内内毒素LPS进入循环系统，加重肝脏损伤及炎症。因此控制炎症是治疗肝脏损伤的关键。大量相关文献报道查尔酮的衍生物L6H21具有明显的抗肿瘤、抗炎、抗有丝分裂、抗菌、治疗心血管和抗高血糖活性等作用。然而L6H21能否保护酒精（EtOH）-LPS诱导的肝损伤及其机制还不清楚。在本研究中，应用C57BL/6小鼠，通过饮食饮用5%酒精10天，之后腹腔注射LPS6小时。L6H21以灌胃方式给予10天。确定EtOH-LPS对肝损伤、肝脂肪变性及炎症的影响，确定L6H21的保护作用及其机制。期待L6H21可能被用来作为治疗酒精性肝病的替代策略。
方法
1.动物实验：
(1)选择成年（8-10周）雄性C57BL/6小鼠，应用Lieber-DeCarli液态饮食法给予酒精，首先给予酒精梯度（1.6%和3.3%EtOH各3天）适应一周后，5%EtOH喂养10天，在最后一天给予LPS腹腔注射6小时诱导肝损伤。L6H21通过灌胃给予10天。根据所给药物的不同，将小鼠分为四组：Control组；EtOH组；EtOH+LPS组；L6H21+EtOH+LPS组。通过H&E染色确定酒精是否引起肝组织学的改变。通过油红O染色和甘油三酯（TG）含量测定检测肝脏脂肪堆积情况。应用试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），以评估肝功能。
(2)通过非特异性酯酶染色液（CAE法）观察中性粒细胞浸润情况。通过F4/80染色检测小鼠肝损伤模型中巨噬细胞浸润情况。
(3)通过免疫荧光染色法确定L6H21对酒精和LPS诱导的肝组织活性氧（ROS）产生的影响。
(4)IκBs/NF-κB复合体相关蛋白（IκBα、p65）的表达水平采用Westernblot法来检测，观察模型中炎症反应及IκBs/NF-κB复合体的解离和激活情况变化。通过Westernblot法检测肝组织中炎症小体相关蛋白（NLRP3）的表达，下游相关调节蛋白（Caspase-1、Casp-1P20）表达变化并用ELISA法测定肝组织匀浆中相关炎症因子（IL-1β、TNF-α）的表达水平，确定L6H21对酒精性肝病模型中炎症小体的影响。
2.细胞实验：
(1)采用小鼠巨噬细胞（Raw264.7细胞）进行体外实验，待细胞在培养瓶底生长的密度达70%后，分组进行实验。将实验分为以下五组：Control组；EtOH组；LPS组；EtOH+LPS组；L6H21+EtOH+LPS组；L6H21组。
(2)采用CCK-8法确定酒精和LPS对Raw264.7细胞活性的影响以及不同浓度L6H21（10uM、20uM）预处理对Raw264.7细胞活性的保护作用；并用TUNEL试剂盒对各组细胞进行免疫荧光染色以检测各组细胞凋亡情况。
(3)分别用DCFH-DA染色、Westernblot法和Caspase-3免疫荧光染色检测不同组别Raw264.7细胞中活性氧产生情况和线粒体凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达水平以及细胞凋亡情况。
(4)采用Westernblot法和免疫荧光染色法检测在不同组别Raw264.7细胞中TLR4-NF-κB通路相关蛋白（TLR、核p65、胞浆p65、GAPDH及Histone）表达的表达水平和NF-κBp65入核情况。
(5)采用Westernblot法研究不同组别Raw264.7细胞中NLRP3炎症小体通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达情况。
结果
1.H&E染色和油红O染色结果表明，与对照组相比，EtOH组肝组织出现脂肪空泡；与EtOH组相比，EtOH+LPS组肝组织脂肪空泡明显增加；而给予L6H21预处理后，脂肪空泡大量减少，减轻了EtOH和LPS诱导的肝脂肪变。肝组织中甘油三酯含量（TG）和血清ALT、AST检测结果表明，与对照组相比，EtOH+LPS组中TG（P＜0.05）和血清ALT（P＜0.05）、AST（P＜0.01）明显增加；与EtOH+LPS组相比，L6H21明显减少了TG（P＜0.05）和血清ALT（P＜0.05）、AST（P＜0.05）水平。
2.CAE染色结果显示，与对照组相比，EtOH组有少量中性粒细胞渗出；与EtOH组相比，EtOH+LPS组发现大量中性粒细胞渗出；而给予L6H21处理后这种炎性细胞渗出明显减少。同时也进行了F4/80免疫荧光染色，与对照组相比，EtOH组肝组织中有少量巨噬细胞浸润，EtOH+LPS组巨噬细胞浸润明显，而给予L6H21处理后，巨噬细胞浸润现象减少。
3.在动物水平，DHE染色结果表明，与对照组相比，EtOH组有少量活性氧产生（P＜0.05）；与EtOH组相比，EtOH+LPS组活性氧水平明显升高（P＜0.05）；而给予L6H21处理之后活性氧水平大幅度降低（P＜0.05）。
4.在动物水平，Westernblot和免疫荧光染色结果表明，与EtOH组相比，EtOH+LPS组TLR4-NF-κB通路的相关蛋白TLR4（P＜0.01）、核p65（P＜0.01）和p-IκB（P＜0.05）表达水平均增加，而IκBα（P＜0.05）表达水平降低；与EtOH+LPS组相比，给予L6H21处理后TLR4-NF-κB通路的相关蛋白TLR4（P＜0.05）、核p65（P＜0.01）和p-IκB（P＜0.05）表达水平明显降低，而IκBα（P＜0.05）表达水平增加。
5.在动物水平，Westernblot结果表明，与EtOH组相比，EtOH+LPS组NLRP3炎症小体通路相关蛋白NLRP3（P＜0.05）和Caspase-1（P＜0.01）表达水平明显上升；而给予L6H21处理后NLRP3通路相关蛋白表达水平有所下降（P＜0.05）。ELISA结果显示，与对照组相比，EtOH+LPS组炎症因子TNF-α（P＜0.01）和IL-1β（P＜0.01）表达水平大幅度上升；而给予L6H21处理后炎症因子TNF-α（P＜0.05）和IL-1β表达水平有所下降（P＜0.05）。
6.在细胞水平，CCK-8实验结果表明，与对照组相比，EtOH组（P＜0.05）和LPS组（P＜0.01）减少了Raw264.7细胞活性；而EtOH+LPS组对细胞活性的损伤作用更明显（P＜0.01）；给予两个浓度的L6H21（10uM、20uM）处理减轻了酒精和LPS对细胞活性的损害，浓度为10uM时效果更明显。接下来的实验选择10uM的L6H21继续进行。TUNEL验结果表明，与对照组相比，EtOH+LPS组细胞凋亡数增多，而给予L6H21处理后细胞凋亡数明显减少。
7.在细胞水平，DCFH-DA检测结果显示，与对照组相比，EtOH组（P＜0.01）和LPS组（P＜0.05）活性氧水平略有上升，而EtOH+LPS组活性氧水平上升明显（P＜0.01）；然而给予L6H21处理后活性氧水平大幅度下降（P＜0.01）。Westernblot结果表明，与对照组相比，EtOH组、LPS组以及EtOH+LPS组线粒体凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3表达增加，Bcl-2表达减少，其中EtOH+LPS组尤为明显；而给予L6H21处理后Bax和Caspase-3（P＜0.01）表达减少，而Bcl-2表达增加。Caspase-3免疫荧光结果和蛋白结果保持一致。
8.在细胞水平，Westernblot和免疫荧光结果表明，与对照组相比，EtOH组、LPS组以及EtOH+LPS组TLR4-NF-κB通路相关蛋白TLR4、胞核p65表达增加，胞浆p65蛋白水平下降，NF-κBp65入核；而L6H21显著抑制TLR4-NF-κB通路激活。
9.在细胞水平，Westernblot实验结果表明，与对照组相比，EtOH组、LPS组以及EtOH+LPS组NLRP3通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达水平均上升，且在EtOH+LPS组更为明显。给予L6H21预处理后，NLRP3通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1和IL-1β表达水平均下降。
结论
1.酒精-LPS明显诱导了诱导C57BL/6小鼠肝损伤和脂肪变性。
2.在体内外实验结果表明，酒精-LPS诱导的肝损伤与激活活性氧、线粒体损伤以及TLR4-NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活相关。
3.L6H21通过抑制ROS产生、TLR4-NF-κB通路和NLRP3炎症小体的激活，改善了酒精和LPS诱导的肝损伤。