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[研究背景]
吸烟是引起早死或残疾的重要因素之一。吸烟可增加心血管疾病、呼吸系统疾病、癌症的发病率，提高缺血性中风、抑郁、帕金森病和阿尔茨海默病以及血管性痴呆等神经退行性疾病的患病风险。短期戒烟可引起体重增加，血糖控制恶化，但长期戒烟可减低多种疾病的患病风险，延长预期寿命。尼古丁是香烟烟雾中的主要成分，也是引起吸烟上瘾的物质，还可引发氧化应激以及炎症反应参与脑缺血性中风、阿尔茨海默病等疾病的发展。此外，有研究表明尼古丁也是香烟中引起体重变化的关键成分。体重变化是由于能量摄入和能量消耗之间的不平衡造成的，而下丘脑是代谢稳态调控的关键部位。目前已有多项研究使用蛋白组学分析尼古丁对前额叶皮质、海马、纹状体、心脏、肾、肝、肺等部位蛋白表达影响，但尼古丁及其戒断对下丘脑蛋白组学研究还未见报道。
[研究目的]
本研究通过蛋白组学分析尼古丁及其戒断后下丘脑的差异表达蛋白，从中筛选与代谢调节相关的关键蛋白，为进一步探索尼古丁及其戒断导致代谢失调的中枢神经调控机制奠定基础。
[研究方法]
1.动物模型构建：尼古丁组小鼠用2mg/kg尼古丁腹腔注射，尼古丁戒断组先注射同等剂量的尼古丁后用生理盐水处理，对照组注射生理盐水。
2.根据文献报道方法，对小鼠的体重变化及摄食量进行动态检测。
3.在建模成功后取小鼠下丘脑组织进行TMT标记的定量蛋白质组学研究，将所鉴定的多肽进行蛋白库比对分析，以获得所鉴定蛋白名称；然后分析这些蛋白表达的差异情况；进一步进行生物信息学分析：包括基因功能注释（GO）富集及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。
4.采用蛋白免疫印迹实验验证部分差异表达的蛋白。
[研究结果]
1.腹腔注射尼古丁小鼠的体重较对照组明显减少，而尼古丁戒断后的小鼠体重增加，回复至与对照组的小鼠体重一致。
2.TMT定量蛋白组学分析显示：与对照组相比，尼古丁组有50种表达差异蛋白，其中上、下调蛋白均为25种；而尼古丁戒断组有61种表达差异蛋白，上、下调蛋白分别为34、26种；尼古丁组/对照组与尼古丁戒断组/对照组相同变化的蛋白只有13种；与尼古丁组相比较，尼古丁戒断组有28种差异蛋白，上、下调蛋白均为14种。这些结果表明：尼古丁可导致下丘脑蛋白表达发生改变，而尼古丁戒断又导致多个新的蛋白表达发生改变。
3.GO功能分析发现在尼古丁/对照组鉴定到的差异蛋白主要参与生殖发育生物学过程；在尼古丁戒断/对照组鉴定到的差异蛋白主要参与金属离子结合的分子功能；在尼古丁戒断/尼古丁组共鉴定的差异蛋白主要参与对电离辐射的反应、和对锌的反应等生物学过程，具有细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性、神经递质结合、门控离子通道活动参与调节突触后膜电位等分子功能。GO功能分析结果显示：尼古丁组与尼古丁戒断后所引起差异表达蛋白没有富集到共同的生物学功能。
4.KEGG富集通路分析，在尼古丁/对照组，共鉴定到50种差异蛋白，其中有25种差异蛋白参与77条信号通路，其中甘油脂代谢通路（AGPAT5和LPIN2）与体重相关。在尼古丁戒断/尼古丁组中，28种差异蛋白中有13种参与59条信号通路，其中硫胺素代谢（ALPL）与体重相关。结果表明：尼古丁组与尼古丁戒断后所引起差异表达蛋白没有富集到共同的信号通路。
5.与对照组比较，尼古丁组表达下调、戒断组表达上调的蛋白有CCNT2、MRPS18B、FADS3，在尼古丁组表达上调、戒断组表达下调的蛋白有CASP3、LCMT2和PEG10，其中CCNT2和PEG10与体重相关。PHACTR3和GLRA2是尼古丁/对照组、戒断组/尼古丁组和尼古丁戒断/对照组三组都共同下调的蛋白。比较尼古丁、尼古丁戒断组、对照组蛋白发现ARID1A、S100A16、G0S2、LPIN2、AGPAT5、CCNT2、PEG10和GRIN2D可能与体重相关。
6.蛋白质印迹结果发现下丘脑CCNT2、GRIN2D在尼古丁处理后表达上调、尼古丁戒断后明显下调。其中，GRIN2D的变化最为显著，且在其他脑组织表达变化不一致，皮层、海马、小脑无明显改变，脑干表达变化趋势与下丘脑一致，提示GRIN2D可能是代谢改变的关键蛋白。
[结论]
本研究发现尼古丁处理及尼古丁戒断可导致下丘脑组织中不同的蛋白表达谱，这可能引起下丘脑响应尼古丁戒断前后发生不同的生理功能变化，进一步影响代谢的中枢神经调节。在与体重变化相呼应的差异蛋白中，谷氨酸受体GRIN2D在下丘脑中表达改变最为显著，而在海马、皮层、小脑组织中没有显著性变化，这一结果暗示尼古丁戒断前后下丘脑GRIN2D表达变化很可能与体重及尼古丁戒断症状相关。
吸烟是引起早死或残疾的重要因素之一。吸烟可增加心血管疾病、呼吸系统疾病、癌症的发病率，提高缺血性中风、抑郁、帕金森病和阿尔茨海默病以及血管性痴呆等神经退行性疾病的患病风险。短期戒烟可引起体重增加，血糖控制恶化，但长期戒烟可减低多种疾病的患病风险，延长预期寿命。尼古丁是香烟烟雾中的主要成分，也是引起吸烟上瘾的物质，还可引发氧化应激以及炎症反应参与脑缺血性中风、阿尔茨海默病等疾病的发展。此外，有研究表明尼古丁也是香烟中引起体重变化的关键成分。体重变化是由于能量摄入和能量消耗之间的不平衡造成的，而下丘脑是代谢稳态调控的关键部位。目前已有多项研究使用蛋白组学分析尼古丁对前额叶皮质、海马、纹状体、心脏、肾、肝、肺等部位蛋白表达影响，但尼古丁及其戒断对下丘脑蛋白组学研究还未见报道。
[研究目的]
本研究通过蛋白组学分析尼古丁及其戒断后下丘脑的差异表达蛋白，从中筛选与代谢调节相关的关键蛋白，为进一步探索尼古丁及其戒断导致代谢失调的中枢神经调控机制奠定基础。
[研究方法]
1.动物模型构建：尼古丁组小鼠用2mg/kg尼古丁腹腔注射，尼古丁戒断组先注射同等剂量的尼古丁后用生理盐水处理，对照组注射生理盐水。
2.根据文献报道方法，对小鼠的体重变化及摄食量进行动态检测。
3.在建模成功后取小鼠下丘脑组织进行TMT标记的定量蛋白质组学研究，将所鉴定的多肽进行蛋白库比对分析，以获得所鉴定蛋白名称；然后分析这些蛋白表达的差异情况；进一步进行生物信息学分析：包括基因功能注释（GO）富集及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。
4.采用蛋白免疫印迹实验验证部分差异表达的蛋白。
[研究结果]
1.腹腔注射尼古丁小鼠的体重较对照组明显减少，而尼古丁戒断后的小鼠体重增加，回复至与对照组的小鼠体重一致。
2.TMT定量蛋白组学分析显示：与对照组相比，尼古丁组有50种表达差异蛋白，其中上、下调蛋白均为25种；而尼古丁戒断组有61种表达差异蛋白，上、下调蛋白分别为34、26种；尼古丁组/对照组与尼古丁戒断组/对照组相同变化的蛋白只有13种；与尼古丁组相比较，尼古丁戒断组有28种差异蛋白，上、下调蛋白均为14种。这些结果表明：尼古丁可导致下丘脑蛋白表达发生改变，而尼古丁戒断又导致多个新的蛋白表达发生改变。
3.GO功能分析发现在尼古丁/对照组鉴定到的差异蛋白主要参与生殖发育生物学过程；在尼古丁戒断/对照组鉴定到的差异蛋白主要参与金属离子结合的分子功能；在尼古丁戒断/尼古丁组共鉴定的差异蛋白主要参与对电离辐射的反应、和对锌的反应等生物学过程，具有细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节活性、神经递质结合、门控离子通道活动参与调节突触后膜电位等分子功能。GO功能分析结果显示：尼古丁组与尼古丁戒断后所引起差异表达蛋白没有富集到共同的生物学功能。
4.KEGG富集通路分析，在尼古丁/对照组，共鉴定到50种差异蛋白，其中有25种差异蛋白参与77条信号通路，其中甘油脂代谢通路（AGPAT5和LPIN2）与体重相关。在尼古丁戒断/尼古丁组中，28种差异蛋白中有13种参与59条信号通路，其中硫胺素代谢（ALPL）与体重相关。结果表明：尼古丁组与尼古丁戒断后所引起差异表达蛋白没有富集到共同的信号通路。
5.与对照组比较，尼古丁组表达下调、戒断组表达上调的蛋白有CCNT2、MRPS18B、FADS3，在尼古丁组表达上调、戒断组表达下调的蛋白有CASP3、LCMT2和PEG10，其中CCNT2和PEG10与体重相关。PHACTR3和GLRA2是尼古丁/对照组、戒断组/尼古丁组和尼古丁戒断/对照组三组都共同下调的蛋白。比较尼古丁、尼古丁戒断组、对照组蛋白发现ARID1A、S100A16、G0S2、LPIN2、AGPAT5、CCNT2、PEG10和GRIN2D可能与体重相关。
6.蛋白质印迹结果发现下丘脑CCNT2、GRIN2D在尼古丁处理后表达上调、尼古丁戒断后明显下调。其中，GRIN2D的变化最为显著，且在其他脑组织表达变化不一致，皮层、海马、小脑无明显改变，脑干表达变化趋势与下丘脑一致，提示GRIN2D可能是代谢改变的关键蛋白。
[结论]
本研究发现尼古丁处理及尼古丁戒断可导致下丘脑组织中不同的蛋白表达谱，这可能引起下丘脑响应尼古丁戒断前后发生不同的生理功能变化，进一步影响代谢的中枢神经调节。在与体重变化相呼应的差异蛋白中，谷氨酸受体GRIN2D在下丘脑中表达改变最为显著，而在海马、皮层、小脑组织中没有显著性变化，这一结果暗示尼古丁戒断前后下丘脑GRIN2D表达变化很可能与体重及尼古丁戒断症状相关。