腌腊肉制品不但拥有悠久的历史,而且具有浓郁的腊香风味、柔韧的质感和良好的耐藏性。涉及腊香风味的生化反应错综复杂,其形成机理尚未完全阐明,但大量研究证实：肌内脂类物质(特别是磷脂)中不饱和脂肪酸的解离、氧化及氧化产物的进一步反应,是形成腊香风味的主要原因。因此,肌内磷脂的酶解与腌腊肉制品风味关系密切。本论文以板鸭为对象,首先从肌内磷脂所处的肌肉内环境入手,检测板鸭加工过程中主要理化指标,了解可能影响肌内磷脂酶解作用的外在因素；同时跟踪加工中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶活力,结合肌内脂质脂肪酸构成变化,明确二者与肌内磷脂降解的相关性；进一步通过粗酶液与卵磷脂模拟反应体系的特征产物分析,确定二者中哪种酶的作用更大；最后,从鸭肉中分离纯化出该酶,并研究其酶学特性。具体研究内容和结果如下：1.板鸭加工中肌内脂质、理化指标和超微结构变化检测板鸭加工过程中肌内脂肪含量、中性酯占总脂比例、游离脂肪酸占总脂比例、磷脂占总脂比例、NaCl含量、TBA值、水分含量、pH值、蛋白质含量、游离氨基酸含量、L*、a*、b*以及超微结构的变化情况。结果表明：在板鸭加工中,pH值、中性酯占总脂比例、b*值变化不明显(P>0.05),水分、肌内磷脂占总脂比例、L*值、a*值显著降低(P<0.05),而NaCl含量、脂肪含量、游离脂肪酸占总脂比例、蛋白质含量、游离氨基酸总含量、TBA值明显升高(P<0.05)；同时肌肉超微结构在风干阶段发生明显的收缩,并出现裂缝。相关性分析表明,磷脂占总脂比例和游离脂肪酸占总脂比例呈显著负相关(r=-0.998,P<0.01),而中性脂占总脂比例和游离脂肪酸占总脂比例显著正相关(P<0.01),表明板鸭加工过程中磷脂发生水解产生了游离脂肪酸；磷脂占总脂比例与NaCl含量、蛋白质含量、脂肪含量、TBA值、水分含量、中性酯比例、游离脂肪酸比例、游离氨基酸总含量等指标极显著相关(P<0.01)。综合上述结果,初步明确了在板鸭加工中,肌内磷脂处于高盐、弱酸的环境,并发生了降解现象,同时肌肉内部结构的破坏和收缩挤压,为磷脂与胞内酶类的接触增加了机会,也为加速磷脂降解产物-游离脂肪酸的氧化提供了可能。2.板鸭加工中磷脂酶A2和磷脂酶C活力变化及其与肌内磷脂降解的相关性跟踪板鸭加工过程中,腿肉中磷脂酶A2、磷脂酶C酶活力以及中性酯、游离脂肪酸、磷脂脂肪酸构成的变化。结果表明：磷脂酶A2的活性在板鸭加工过程中逐渐下降(P<0.05),但到风干12天时仍能保留83.70%的酶活力；磷脂酶C的活性从原料到干腌时显著升高(P<0.05),然后从干腌到风干6天显著下降,在风干6天到12天时显著升高(P<0.05),在加工末期磷脂酶C保留86.78%的酶活力；游离脂肪酸和中性脂中不饱和脂肪酸的比例逐渐升高(P<0.05),二者的增加量与磷脂中多不饱和脂肪酸的减少量显著相关(r=-0.841,P<0.05,r=-0.946,P<0.01),对单个脂肪酸而言,磷脂中亚油酸(C 18：2)和花生四烯酸(C 20：4)显著减少(P<0.05),然而在游离脂肪酸和中性酯中它们显著升高(P<0.05)。上述结果,初步证实了板鸭加工中,磷脂酶A2和磷脂酶C参与了肌内磷脂的水解。3.磷脂模拟体系中磷脂酶A2和磷脂酶C的酶解作用比较以鸭肉中客观存在的一种卵磷脂(C18:2/C16:0PC)为底物,与鸭肉粗酶液组成模拟体系,反应条件与板鸭加工条件(温度10℃以下)和产品特点(盐分含量8.92%、pH6.2左右)相对应,即反应条件为pH6.2、温度9℃、NaCl含量8.92%、时间为60h,通过HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发光散射检测器)分析特征酶解产物。结果如下：建立了HPLC-ELSD卵磷脂模拟反应体系中酶解产物的分析方法；首先通过二氟甲烷-甲醇(2/1,体积比)充分萃取卵磷脂模拟反应体系中的酶解产物,再通过HPLC-ELSD对产物进行分析；HPLC的色谱柱为XBridge C18,250 mm×4.6 mm×5.0柱温40℃;流动相A、B、C分别为二氯甲烷、乙腈、水,采用梯度洗脱；ELSD检测器：氮气雾化,增益50,雾化温度65℃,气流压力45 psi；在该色谱条件下卵磷脂(PC)、溶血卵磷脂(LPC)、脂肪酸(FA)、甘油单酯(MG)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)分离良好,回归方程的相关系数均超过0.99；通过HPLC-ELSD分析,模拟体系中卵磷脂的初始含量为1978.24μg,酶解反应后下降到1626.35μg,酶解产物中检测少量的磷脂酶A2特征性产物LPC和FA(分别为49.67μg和42.25μg),但并未发现磷脂酶C的酶解产物DG。以上结果证实磷脂酶A2在磷脂酶解中作用更大。4.磷脂酶A2的分离纯化及其酶学性质从鸭腿肉中提取纯化磷脂酶A2后,研究其最适温度、最适pH、热稳定性、动力学方程、金属离子对酶活力的影响等酶学特性。结果表明：利用缓冲液(50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA,3 mM MgCl2,50 mM KCl,10 mM 2-mercaptoethanol, pH 7.5)从鸭腿肉中提取磷脂酶A2粗酶液,随后依次采用70%硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose (DE-52)阴离子交换层析100%线性洗脱、Superdex 200凝胶过滤层析、Source 15Q阴离子交换层析45 min达到100%缓冲液(50 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,3 mM MgCl2,50 mM KCl, 10 mM 2-mercaptoethanol,1 M NaCl, pH 7.5)线性洗脱,最终获得了基本达到电泳纯的磷脂酶A2,经SDS-PAGE测定发现其分子量约为50 kDa,纯化后磷脂酶A2的比活力达到282.1 U/mg,纯度提高了201.5倍,回收率为1.5%；该酶的最适反应温度为32℃,最适反应pH值为6.0,32℃以下有较好的稳定性,而在60℃时极易失活,该酶作用底物为L-α-1-棕榈酰基-2-[14C]花生四烯酸-sn-甘油磷脂酰胆碱时的Km为0.03 mmol/L,最大反应速度Vmax为1000 U/mg；Cu2+、Ca2+对鸭肉磷脂酶A2有激活作用,其中Cu2+的激活作用更为明显,在浓度为10 mM时,鸭肉磷脂酶A2的相对酶活力增加了51.33%,而Mn2+和Zn2+对磷脂酶A2的酶活力影响不大。上述结果表明,鸭肉中存在的这种磷脂酶A2,在板鸭加工条件(低温、高盐)下其酶活力相对稳定,且肌肉内环境的pH值接近该酶的最适pH值。综上所述：板鸭加工过程中,伴随着肌肉理化指标和超微结构的改变,肌内磷脂在磷脂酶A2、磷脂酶C等作用下发生了水解；通过分析卵磷脂模拟反应体系特征酶解产物和磷脂酶A2的酶学特性,共同证实了磷脂酶A2在肌内磷脂水解中的作用更重要。