阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是常见的中枢神经系统退行性变疾病,主要以进行性认知功能障碍及行为损害为特征。2005年,ADI在《TheLancet))上发表的“德尔非研究共识”指出截至2005年全球有2430万痴呆患者,每年还以460万(每7秒1例)的速度上升。每20年增加1倍的患病人数,预测到2040年,全球痴呆病例将达到8110万之多。中国作为目前世界上痴呆人数最多且增长速度最快的国家。这都给社会及家庭增加了沉重的经济及心理负担。Alzheimer病主要的病理改变是淀粉样蛋白沉积及神经元纤维缠结。目前病因尚未明确,其主要的假说包括,淀粉样蛋白瀑布假说、tau蛋白假说、神经血管假说、氧化应激、线粒体功能障碍、炎症机制等多种假说。而其中影响较广的是淀粉样蛋白瀑布假说,认为Aβ的生成与清除失衡导致过度沉积是导致神经元变性和痴呆的起始事件。目前越来越多的研究认为小胶质细跑(Microglia)在阿尔茨海默病的发病过程起到至关重要的作用。小胶质细胞活化后可介导炎症反应,释放炎症因子如IL-1、IL-6及TNF-a等,从而导致神经元损害；甚至参与到淀粉样蛋白的清除,所以不能排除小胶质细胞吞噬、降解能力下降导致Aβ沉积的可能性。多种因素如衰老、凋亡等均可导致小胶质细胞活化,从而引起颅内的炎症反应。高迁移率蛋白Bl(high mobility group box-1,HMGB1)是近年来才发现的一个晚期炎症因子,其参与了败血症、肿瘤、急性脑损伤、胰腺炎等多种炎症疾病的发生发展。细胞外IMGB1通过与其受体RAGE、 TLR2及TLR4等结合后触发多种信号途径,发挥其致炎效应。在颅内,HMGB1在细胞因子刺激后可被释放,并参与炎症反应过程。Andrey Mazarati等发现在AD患者脑内中,HMGB1的水平是处于升高的状态,所以认为HMGB1介导的炎症反应可能是此类神经变性疾病的的一个危险因素。K. Takata发现在AD模型脑内HMGB1的浓度明显增加,Ap斑块周围积聚着较多的HMGB1. HMGB1通过紧密结合Aβ42,稳定Aβ42的寡聚体状态,影响小胶质细胞清除Aβ42的能力,同时增加Aβ42自身的毒性。随后Takata等于2012年发现未有HMGB1存在的情况下,小胶质细胞胞质中Aβ1-40比Aβ42更容易降解,但在HMGB1干预的情况下,小胶质细胞内Aβl-40降解能力明显下降,从而导致胞外的Aβ40沉积增多。目前HMGB1在AD的作用机制尚不明。有研究认为,HMGB1通过与Ap结合,从而抑制小胶质细胞吞噬Aβ,或者通过TLR-4及RAGE途径造成记忆损伤。那究竟HMGB1在小胶质细胞的作用如何,我们设计本研究：采用1μmol/LAp1-40及0.3μmol/L HMGB1单独或联合干预原代小胶质细胞,并且利用抗RAGE抗体进行阻断试验,采用ELISA技术测定TNF-α、IL-6、IL-1释放水平,实时荧光定量PCR术小胶质细胞表面RAGE的表达。检测结果显示：Aβ及HMGB1均可刺激小胶质细胞分泌TNF-a、IL-6,但Ap的刺激程度明显强于HMGB1(P<0.05)。HMGB1对Aβ诱导的小胶质细胞释放TNF-a、 IL-6无明显正反馈。抗RAGE抗体可抑制Ap诱导小胶质细胞释放TNF-a及IL-6,考虑Aβ可能通过结合小胶质细胞表面的RAGE产生炎症反应。[材料和方法]1.材料：刚出生1天内的SD乳鼠购自中山大学北校区动物实验中心(许可证号：SCXK(粤)2011-0029),DMEM/F-12(1：1)培养基(美国GIBCO)、胎牛血清(FBS)(美国GIBCO)、0.25%胰蛋白(含0.02%EDTA)(吉诺生物医药技术有限公司)、L-多聚赖氨酸(MW：15-30w)(美国sigma)、多聚甲醛(广州化学试剂厂)、抗Iba抗体(英国Abcam)、 FITC-山羊抗小鼠IgG(Santa Cruz)、Aβ40(Sigma公司)、高迁移率蛋白B1(HMGB1)(sigma公司)、rRAGE Affinity Purified Goat IgG(R&D公司)、六氟异丙醇(HIFP)(美国sigma)、二甲基亚矾(DMSO)(广州威佳生物有限公司)、考马斯亮蓝R250(研域(上海)化学试剂有限公司)、阳极缓冲液(康为世纪)、阴极缓冲液(康为世纪)、Tricine-SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(康为世纪)、PageRuler Prestained protein ladder(Thermo Scientific)、Rat TNF-alpha ELISA Kit(MultiSciences公司)、Rat IL-6ELISA Kit (MultiSciences公司)、Rat IL-1ELISA Kit(MultiSciences公司),Revertaid first strand cDNA synthesis试剂盒(Thermo Scientific)。主要仪器：超净工作台(中国,AIRTECH),HEPA Class100二氧化碳培养箱(美国,Thermo Foma)、摇床(中国,Kylin-Bell)、倒置显微镜(日本,OLYMAPUS)、激光扫描共聚焦显微镜(德国,Leica)、低温高速离心机(德国,Beckman)、 Synergy TM HT多通道酶标仪(美国,BIO TEK)、 Mini-PROTEAN电泳槽(中国,BIO-RAD)、消毒手术器械、实时荧光定量PCR仪(美国,MJResearch Inc.)、 RT-PCR仪器(美国,Bio-Rad).NANoDROP2000分光光度计核酸OD检测仪(美国Thermo SCIENTIFIC)2.方法：2.1原代小胶质细胞培养：将刚出生1天内的SD乳鼠用75%酒精消毒后固定,取出脑组织,去除脑干,剥离脑膜及血管,置于离心管中剪碎、0.125%胰酶37℃水浴消化、血清终止消化,70μm滤网过滤、离心、重悬、计数后接种至75cm2培养瓶(含15%FBS、1%青链霉素的DMEM/F12完全培养基)中。C02培养箱中培养24小时轻摇后换液,随后每4天全量换液一次,10天左右后可见明显的细胞分层。上层细胞主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞,呈圆形,透光性较好,下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。摇床振摇,180/min,15min,将培养基吸出,收集脱落的细胞,1500r/s5min离心,去除上清液,加入完全培养基,吹打混匀,计数,种入6孔板(已放置盖玻片),37℃5%C02温箱培养15-30分钟,更换培养基,即去除延迟贴壁的少突胶质细胞,贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。免疫荧光术鉴定小胶质细胞表面的Ibal,阳性率大于95%,可用于后续试验。2.2Aβ寡聚体的制备：将0.22m1六氟异丙醇(HFIP)(已预冷)加入到Aβ1-40粉剂(1mg)试剂瓶中,室温孵育1h,充分溶解Aβ1-40,置在冰上10min左右后移至通风橱内,待HFIP挥发风干后可见透明的Ap肽膜,加入44μL新鲜无水100%DMSO溶解,加入DMEM/F12培养液将Ap浓度稀释成1μmol/L4℃孵育24h后,14000r/min低温离心10min后取其上清液。分装后放置在-20℃保存。用上样缓冲液预处理Ap进行电泳4小时左右,考马斯亮蓝染色鉴定。2.3建立小胶质细胞炎性模型：分离纯化后小胶质细胞以3×105／孔接种到六孔板中,培养24小时,采取lμmol/LAβ40单体单独及联合03μmol/LHMGB1干预组、单独给予HMGB1干预小胶质细胞及空白对照组,即为：Aβ1-40(1μmol/L）、 Aβ1-4O（1μmol/L)+HMGB1(0.3pmol/L）、HMGB1(0.3μmol/L)、Aβ1-40(1μmol/L)+抗RAGE抗体(提前1h处理)、Aβ1-40(lμmol/L)+HMGB1(0.3gmol/L)+抗RAGE抗体(提前1h处理)、空白组(不加任何药物),分别培养6小时、24小时收集上清液,检测小胶质细胞炎症介质TNF-α、IL-6及IL-1释放水平。严格按照ELISA试剂盒说明书操作。2.4进行上述操作处理,培养24h后弃去上清液,利用TRIZOL法提取Aβ1-40（1μmol/L)、 Aβ1-40(1μmol/L)+HMGB1(0.3nmol/L)、HMGB1(0.3μmol/L）、空白组(不加任何药物)各组的总RNA并测定RNA浓度,进行逆转录呈cDNA,采用荧光定量PCR检测小胶质细胞表面RAGE的表达。3.统计学方法ELISA及PCR结果为计量资料,均采用x±s表示,采用SPSS13.0进行统计,ELISA数据采用析因分析,PCR数据采用方差分析,组间比较采用LSD进行两两比较。检验水准a=0.05。[结果]1.原代小胶质细胞的培养、分离及鉴定：倒置显微镜下观察可见小胶质细胞部分呈圆形或类圆形,另有呈现梭状,有伸出突起；采用免疫荧光术鉴定纯化后的小胶质细胞,胞质Iba的阳性率在95%以上。2.各组上清液TNF-a浓度的测定：各实验组间TNF-a浓度比较差异具有统计学意义(F=57.128,P=0.000)。Aβ1-40组、Aβ1—40+HMGB1组、HMGB1组、Ap1-40+抗RAGE抗体组、Aβ1—40+HMGB1+抗RAGE抗体组的TNF-a浓度均高于空白对照组,Aβ1-40组的TNF-a浓度高于Aβ1-40+抗RAGE等其余各组,Aβ1—40+HMGBl组高于Aβ1—40+HMGBl+抗RAGE抗体组(P=0.000),HMGB1与各组间TNF-a浓度比较均有统计学差异(P<0.05)。同一处理方法,不同时间点间上清液中TNF-a浓度比较具有统计学差异,24h时收集的上清液TNF-a浓度低于6h时收集的上清液中TNF-a浓度(F=209.122,P=0.000)。3.各组上清液中IL-6浓度的测定值：各实验组上清液中IL-6浓度比较具有统计学差异(F=18.102,P=0.000).Aβ1-40组、Aβ1-40+HMGB1组、HMGB1组的IL-6浓度均高于空白对照组,同时,Aβ1-40组浓度高于Aβ1-40+抗RAGE抗体组,Aβ1-40+HMGB1组高于Aβ1-40+HMGBl+抗RAGE抗体组(P=0.000),HMGB1干预组与各组间均具有统计学意义(Aβ1-40组除外)(P<0.05)。同一处理方法,不同时间点间上清液中IL-6浓度比较无统计学差异(F=0.177,P=0.678)。4.各组上清液中IL-1p浓度的测定值：各实验组上清液中IL-1p浓度比较具有统计学差异(F=51.019,P=0.000)。Ap1-40组、Aβ1-40+HMGB1组、Ap1-40+抗RAGE抗体组、Aβ1-40+HMGB1+抗RAGE抗体组的IL-1p浓度均高于空白对照组。Aβ1-40组浓度高于Aβ1-40+抗RAGE抗体组(P=0.000),Aβ1-40+HMGB1组IL-1β浓度高于其余各实验组及空白对照组,HMGB1组的IL-1p浓度低于各实验组比较具有统计学差异(P=0.000)。同一处理方法,不同时间点间上清液中IL-1p浓度比较有统计学差异(F=33.087,P=0.000),24h时收集的上清液高于6h时收集的上清液的IL-1p浓度。5.各实验组Aβ、Aβ+HMGB1及HMGB1小胶质细胞表面RAGE mRNA表达水平：实验组的RAGEmRNA表达水平高于空白对照组的RAGE mRNA表达水平,但差异无统计学意义(F=I.385,P=0.316)。[结论]1.考马斯亮蓝染色法可直观、简易地检测Ap分子量的大小、鉴定Ap的聚集形态。2.Ap及HMGB1均可刺激小胶质细胞的炎症反应,但Ap的刺激程度明显强于IIMGB1。HMGB1对Ap诱导的小胶质细胞炎症反应物无明显协同作用。3.抗RAGE抗体可抑制Aβ诱导小胶质细胞诱导的炎症反应。