副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属,是一种非溶血性的、依赖于NAD、具有多种形态的革兰氏阴性菌。该菌是猪Glasser’s病的病原,以多发性浆膜炎/关节炎、脑膜炎以及败血症为主要特征。副猪嗜血杆菌的感染可引发猪群的高发病率和死亡率,并且经常与其它病原体混合感染或继发感染,给养猪业造成了巨大的经济损失。但是关于副猪嗜血杆菌致病机制的研究目前主要集中于其免疫逃避机制以及其毒力因子方面,很少有关于副猪嗜血杆菌与宿主细胞之间相互作用的研究。细胞自噬是真核细胞所特有的一种胞内机制,是细胞对不利于自身生存的外部刺激发生的一种非特异性应答,通过蛋白酶消化细胞内聚集的短寿命蛋白或通过形成自噬体将受损细胞器或长寿命蛋白运送到溶酶体内消化,从而维持细胞内稳态,对细胞健康的维持发挥重要作用。自噬在哺乳动物细胞针对胞内病原体感染的天然免疫反应过程中发挥着重要作用,目前已发现多种病毒、细菌、真菌及寄生虫可诱导哺乳动物细胞发生自噬。TGF-β1是一种多功能的多肽生长因子,是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌调节因子,广泛参与调节生物活性,包括细胞分化、血管生成、细胞程序性死亡,纤维化和细胞免疫等。TGF-β1还有一个重要的作用就是调节细胞外基质蛋白,如纤连蛋白(Fn)、胶原蛋白、层粘连蛋白,以及几种整合素蛋白(integrin)的表达,可以借此影响病原体对宿主细胞的吸附和侵入能力。在本研究中,首先我们证实了副猪嗜血杆菌在感染PK-15细胞的过程中可以诱导自噬,在此基础上,我们进一步研究了副猪嗜血杆菌诱导自噬与其毒力及对细胞的侵袭力之间的关系,阐明了自噬在副猪嗜血杆菌感染过程中发挥的作用,并初步探究了副猪嗜血杆菌诱导自噬的信号通路;另一方面,我们研究了 TGF-β1对副猪嗜血杆菌吸附和侵入能力的影响,并借助RNA干扰实验阐明了 TGF-β1与副猪嗜血杆菌之间的相互作用是通过纤连蛋白(Fn)以及整合素蛋白(integrin)α5这个中间介质来完成。另外,我们也初步探究了 TGF-β1与自噬之间的关系。具体研究如下:1副猪嗜血杆菌感染诱导PK-15细胞发生自噬副猪嗜血杆菌(H.parasuis)作为一种猪体上呼吸道常在菌,在应激条件下,会引起猪的Glasser猪的病。但是目前对其致病机制的研究主要集中在免疫逃避和对其毒力因子的研究上,不能反映副猪嗜血杆菌在感染过程中与宿主细胞之间的相互作用。自噬是病原体与宿主相互作用的一个重要纽带,但是目前还没有关于自噬在副猪嗜血杆菌感染中的报道。本研究阐明了副猪嗜血杆菌感染PK-15细胞过程中诱导自噬的情况,借助于串联表达GFP/RFP/LC3蛋白的双标签腺病毒,通过Western-blot、激光共聚焦显微镜以及透射电镜这三个方面证实副猪嗜血杆菌能在PK-15细胞中诱导明显的自噬,而且自噬水平的高低与副猪嗜血杆菌的复制和增殖有关;另外,我们进一步研究了自噬与副猪嗜血杆菌毒力之间的关系,发现副猪嗜血杆菌毒力与诱导自噬的能力以及侵入能力呈正相关;最后,通过RNA干扰实验验证几个经典自噬相关蛋白Beclin-1/ATG5和ATG7的作用,初步确定副猪嗜血杆菌诱导的自噬是通过Beclinl-Atg5-Atg7这条经典通路。2 TGF-β通路对副猪嗜血杆菌感染PK-15细胞的影响TGF-β1可以通过调控纤连蛋白(Fn)、整合素蛋白(integrin)或者其他细胞外基质蛋白(ECM蛋白)的表达从而在细菌入胞过程中发挥着重要作用。我们推测TGF-β1的水平也会对副猪嗜血杆菌入侵PK-15细胞有着一定的影响。研究发现以下几个方面,感染副猪嗜血杆菌的PK-15细胞上清TGF-β1表达水平升高。对PK-15细胞进行TGF-β1预处理能显著降低副猪嗜血杆菌的入侵量。TGF-β1预处理或者副猪嗜血杆菌感染都能使PK-15细胞纤连蛋白(Fn)和整合素蛋白α5(integrin)表达量明显升高。通过用特异性的RNA干扰片段干扰PK-15细胞中Fn和α5的表达会引起副猪嗜血杆菌侵入能力增强,特别是干扰α5会同时引起副猪嗜血杆菌吸附能力增强,Fn的干扰没有此效果。我们的试验首次证明了 TGF-β1、Fn以及α5 integrin的表达能够抑制副猪嗜血杆菌对PK-15的侵入作用。