体外成熟培养(IVM)是现代胚胎工程中的一个主要技术环节,其主要目的是充分利用卵巢上丰富的卵母细胞资源用于体外受精、核移植和转基因等相关胚胎工程技术以及发育生物学机理等的研究。为了优化黄牛卵母细胞体外成熟培养体系,顺利开展胚胎工程领域内其他相关研究,本论文研究了黄牛卵母细胞体外成熟时,激素、丙酮酸钠、培养基平衡时间、培养时间、培养密度、卵泡大小、卵丘细胞、卵巢热应激及不同应激条件下保存时间对卵母细胞体外成熟的作用。(1)在单因素多水平实验中发现,在含有 10% 胎牛血清(FBS)的 TCM199 中添加 10 μg/ml FSH(80.18%)、10 μg/mlLH(80%)、1 μg/ml E2(76.67%)和 0.3 mM 丙酮酸钠(77.5%)能够显著促进卵母细胞体外成熟,与其它浓度组相比差异显著(P<0.05)。(2)分别用灭活和未灭活的 FBS 培养卵母细胞,结果发现成熟率无显著差异(P>0.05)。(3)培养前将培养基分别平衡0 h,5 h,10 h 和 20 h,结果发现平衡 20 h 卵母细胞体外成熟(80%)显著高于其他组(P<0.05)。(4)50 μl 微滴中分别培养 5,10,15,20 枚 COCs,结果发现 10 枚/50 μl的体外成熟率(76.67%)显著高于 5 枚/50 μl 的培养密度(33.33%,P<0.05),但与15 和 20 枚/50 μl 差异不显著(P>0.05)。(5)将卵母细胞分别培养 16 h,20 h,24 h和 28 h,结果发现培养 24 h 成熟率(80%)显著高于 16 h(42.5%,P<0.05),但与 20h 和 28 h 相比差异不显著(P>0.05);随着培养时间延长(16h,20h,24h,28h),Ⅰ型第一极体排出率逐渐降低(80%,50%,49%,32%),Ⅲ型第一极体排出率逐渐上升(0%,7.69%,21.46%,36.36),Ⅳ型第一极体排出率无显著变化(0%,3.85%,4.39%,4.55%)。(6) 直径 2~6 mm 的中等卵泡获得的 COCs 卵丘包裹最好,其中 A 级和 B 级卵母细胞获得率为 87.73%,高于大卵泡(66.67%)、小卵泡(65.38%)和充血卵泡(13.10%),其体外培养成熟率(73.08%)也显著高于大卵泡、小卵泡和充血卵泡(53.12%,45%,0%,P<0.05)。(7)COCs 成熟培养后观察发现,卵丘四级和三级扩展的卵母细胞成熟率(76.43%,76.12%)显著高于二级,一级和零级扩展(44.97%,26.81%,0%,P<0.05);A 级和 B 级卵母细胞体外成熟率(78.33%,76.66%)显著高于 CD 级和 EF级(38.33%,0%,P<0.05),说明卵丘扩展与卵母细胞成熟有关。(8)卵巢采集后 2 h运回实验室,分别于 4℃,15℃,25℃,37℃和 39℃保存 0.5 h,再进行成熟培养,结果发现卵母细胞成熟率分别为 16.67%,43.33%,63.33%,73.33%和 60%;结果还发现,卵巢保存时间长时,保存温度可适当降低,有利于卵母细胞培养成熟,保存 6 h 适宜的保存温度为 25℃(成熟率为 53.33%)。以上结果说明,TCM199 中添加 10% FBS,10 μg/ml FSH,10 μg/ml LH,1 μg/ml 17-βE2 和 0.3 mM 丙酮酸钠,在培养前平衡 20h,培养 24 h 有利于卵母细胞成熟;自中等卵泡采集的并且卵丘颗粒细胞包裹 2 层促进卵母细胞成熟;10 枚/50 μl 的培养密度有利于卵母细胞体外成熟;卵巢长时间运输