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研究背景胃癌作为全球第五大恶性肿瘤和第三大肿瘤死亡原因,对人类生命以及生存质量造成严重的威胁。尽管目前多种医学治疗手段已得到广泛应用,但胃癌患者的病死率仍高达50%。因此了解胃癌发生和治疗耐受机制对于胃癌的精准治疗尤为重要。激活转录因子 2(Activating Transcription Factor 2,ATF2)是 DNA结合蛋白的基本亮氨酸拉链(bZIP)家族的成员之一,在肿瘤的放疗和化疗过程中发挥着重要的作用。ATF2在不同遗传类型的肿瘤中具有双重功能(能发挥致癌活性或者抑癌功能),但是ATF2在胃癌中的具体功能尚未阐明。目的明确ATF2在胃癌中的功能,阐明ATF2及其活化对胃癌化疗药物(顺铂)敏感性的影响;明确在胃癌中ATF2所发挥的功能与细胞p53基因状态的关系,进一步了解ATF2在肿瘤中的分子作用机制,为胃癌的治疗提供重要的理论依据和潜在治疗策略。方法采用免疫组化(IHC)方法检测胃癌组织中ATF2的表达,并通过免疫荧光法检测ATF2在胃癌细胞中的定位情况。cBioportal数据库用于分析ATF2和p53的基因状态;而STRING数据库则用于预测与ATF2和p53相互作用的潜在蛋白质。通过GST-pull down实验和免疫共沉淀实验探讨ATF2和p53蛋白之间的相互作用。采用Western blot技术检测顺铂作用对不同胃癌细胞ATF2和p53蛋白表达水平的影响;通过细胞增殖实验和细胞克隆形成实验研究ATF2对具有不同p53基因状态的胃癌细胞的增殖和克隆形成能力的影响。通过体内实验验证过表达ATF2对胃癌细胞移植瘤生长的影响。肿瘤组织切片的苏木素-伊红(H&E)染色用于检测肿瘤组织坏死情况。采用SPSS 21.0统计学软件处理实验数据,所有计量数据资料均以均数±标准差(mean±SEM)的形式表示。采用Kaplan-Meier方法和Log-rank检验分析患者的总生存率。采用配对样本t检验法比较对照组和实验组之间的差异。取α=0.05,p值<0.05时视为具有统计学意义。结果(1)胃癌组织ATF2的表达与患者生存时间特别是化疗后患者生存时间相关,ATF2高表达组患者预后较差。免疫组化结果显示,ATF2在约43%(22/51)的人胃癌组织中表达下调。Kaplan-Meier和Log-rank生存分析结果显示高表达ATF2的胃癌患者总体生存预后较差(p<0.01)以及接受化疗的ATF2高表达患者生存时间显著下降(p=0.044)。但ATF2表达的高低对仅进行手术切除的胃癌患者的生存时间无明显影响(p=0.19)。(2)顺铂对ATF2过表达的MGC-803、HGC-27、AGS胃癌细胞的增殖和克隆形成能力影响不同,且p-ATF2(磷酸化ATF2)在三种细胞中的表达不一致。Western blot结果显示,顺铂显著诱导p-ATF2在ATF2过表达的MGC-803和HGC-27细胞中表达,而在ATF2过表达的AGS细胞中,p-ATF2的表达不明显。细胞增殖和克隆形成实验结果显示,顺铂能够显著抑制ATF2过表达的AGS和MGC-803细胞的增殖能力(p<0.05)和克隆形成能力,而对HGC-27细胞的作用不明显。(3)ATF2与p53具有结合潜力,p53的基因状态影响顺铂处理后过表达ATF2的HCT-116细胞的增殖能力和p-ATF2的表达。MGC-803和HGC-27为p53突变型胃癌细胞(其中HGC-27细胞的p53发生突变失活),AGS为p53野生型胃癌细胞。STRING数据库与Venny软件的分析结果显示ATF2和p53均能与多种分子结合,且在已发表的202个与ATF2互作的蛋白质分子中,有53个蛋白质与p53存在相互作用。Western blot结果显示,顺铂可显著促进HCT-116-p53-/--ATF2-WT细胞p-ATF2 的表达(P<0.01),但对 HCT-116-p53+/+-ATF2-WT 细胞 p-ATF2 的表达不明显。细胞增殖实验结果显示,过表达ATF2-WT(p<0.05)、ATF2-T71E(p<0.01)的HCT-116-p53+/+细胞对顺铂的敏感性增加,细胞增值能力受到显著抑制。然而,在 HCT-116-p53-/-细胞中,过表达 ATF2-WT(p<0.01)、ATF2-T71E(p<0.05)组对顺铂的耐受性增加,细胞增殖能力增强。(4)ATF2与p53存在体内、外相互作用,且ATF2可通过p53的反式激活结构域(TAD)与p53结合。免疫荧光结果显示,ATF2与p53共定位于细胞核内。Discovery Studio分子对接软件分析发现ATF2与p53的晶体结构存在潜在结合区域。GST-pull down实验结果显示p53蛋白可与ATF2-GST蛋白在体外发生相互作用。免疫共沉淀实验则进一步证实细胞内ATF2能够与p53的反式激活结构(TAD)结合,而p53 TAD结构域的缺失(即dTAD)则导致ATF2与p53之间的相互作用消失。(5)p53在人胃癌组织中具有高突变率和高剪接率。cBioportal数据库分析结果显示,p53在胃癌组织(n=395)中的突变率最高,接近50%。并且在胃癌组织中,p53主要发生错义突变,其中R175、R248、R273是胃癌p53 DNA结合结构域上的热点突变位点。对人胃癌组织p53转录本的分析结果表明,与癌旁正常组织相比,肿瘤组织中发生氨基末端TAD结构域缺失的p53异构体的可变剪接率显著增高(p<0.01)。(6)高表达ATF2可促进p53功能缺失的胃癌细胞移植瘤的生长。动物荷瘤实验结果显示,与HGC-27空载体对照组移植瘤相比,接受顺铂治疗的ATF2过表达组的肿瘤体积明显增大。HGC-27细胞移植瘤组织切片的HE染色结果显示,与过表达ATF2组相比,接受顺铂治疗的空载体对照组的肿瘤组织内出现大面积坏死。结论本研究表明胃癌组织中ATF2的高表达与接受化疗的胃癌患者的5年预后不良有关。ATF2在胃癌细胞中的功能与细胞p53的基因状态有关,高表达ATF2可增强p53野生型胃癌细胞对顺铂敏感性,但同时也增强了 p53突变失活的胃癌细胞对顺铂的耐药性,进而促进肿瘤细胞的生长。总之,我们的研究初步阐明了 ATF2在胃癌化疗药物顺铂中的分子功能,并为胃癌化疗提供了新的理论基础。