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目的:采用液相色谱-质谱联用技术(液质联用)检测开心散中主要有效成分,为后续的实验研究提供质量保证。观察开心散低、中、高剂量对东莨菪碱致认知障碍模型小鼠学习记忆的影响,探讨开心散改善模型小鼠学习记忆能力的可能机制,为认知障碍的治疗提供实验依据。方法:实验一:开心散有效组分的质量控制将开心散的人参、茯苓、石菖蒲、远志四味中药按照3:3:2:2比例投料,采用加热回流提取法进行萃取,分别收取石菖蒲挥发油及人参提取液;将石菖蒲药渣、人参药渣与茯苓、远志共煎后合并药液。减压浓缩后按比例将石菖蒲挥发油与提取原液混匀,检测前采用固相萃取进行预处理。将人参皂苷Rg1、远志皂苷元、远志山酮III、β-细辛醚、α-细辛醚标准品分别用甲醇配置成浓度为50μM/L待测溶液。最后采用液质联用技术对开心散进行有效成分检测。实验二:开心散对认知障碍模型小鼠学习记忆的影响及机制研究1.行为学实验:8周龄健康SPF级雄性昆明小鼠72只,随机分为:正常组、模型组、开心散低剂量组、开心散中剂量组、开心散高剂量组、阳性药对照组。除正常组和模型组予0.9%生理盐水外,开心散组分别以0.7 g/kg/d、1.4 g/kg/d、2.8 g/kg/d给药,阳性药对照组给予3 mg/kg/d的多奈哌齐,治疗周期为14天,每日一次。给药后第8日开始行为学测试,测试前1小时灌胃给药,测试前半小时造模干预,除正常组用0.9%生理盐水代替外,其余各组小鼠予以东莨菪碱3 mg/kg/d腹腔注射。2.生化指标检测:采用尼氏染色观察小鼠脑内神经元损伤状况;TUNEL染色观察小鼠脑内神经元凋亡状况;采用Western Blot法观察小鼠脑海马和皮质中Bcl-2、Bax、PSD95、SYN、BDNF蛋白的表达变化;采用试剂盒检测法对小鼠脑海马和皮质中Ach、ChAT、AChE、SOD、GSH-Px、ROS、MDA的活性及含量进行检测。结果:1.开心散有效组分的质量控制通过液质联用及其二级质谱碎片结合标准品可指认的包括5个有效成分,分别是远志皂苷元、远志山酮III、人参皂苷Rg1,β-细辛醚和α-细辛醚。2.开心散对认知障碍模型小鼠空间学习记忆功能的作用(1)Morris水迷宫定位航行结果提示:模型组小鼠逃避潜伏期较正常组小鼠显著延长(P<0.01),开心散的低、中、高剂量组和阳性药多奈哌齐组均可缩短模型小鼠的逃避潜伏期(P<0.01)。游泳轨迹显示:与正常组和给药组相比,模型组小鼠表现出杂乱无序的游泳轨迹。空间探索结果提示:模型组小鼠在穿越平台次数、目标象限停留时间较正常组显著减少(P<0.01),开心散的低、中、高剂量组和阳性药多奈哌齐组均可改善上述指标(P<0.01);在游泳速度方面,模型组小鼠明显慢于正常组(P<0.05),而给药组与模型组之间的差异无显著性(P>0.05)。(2)Y迷宫结果提示:模型组小鼠在三个臂中的交替百分比较正常组明显减少(P<0.01),开心散中、高剂量组和阳性药多奈哌齐均可提高模型小鼠在三个臂中的交替百分比(P<0.05)。3.开心散对认知障碍模型小鼠生化指标的影响(1)尼氏染色结果提示:和正常组相比,模型组小鼠海马区神经元数目减少,细胞内尼氏小体减少甚至消失,呈空泡泡样,排列紊乱,开心散低、中、高剂量组及阳性药多奈哌齐可减轻神经元损伤,改善神经细胞存活状况。(2)TUNEL染色结果提示:和正常组相比,模型组小鼠皮质区神经元数目减少,凋亡小体显著增加,部分神经元形态异常,开心散低、中、高剂量及阳性药多奈哌齐可减轻神经元凋亡状况。(3)Western Blot结果提示:与正常组相比,模型组小鼠海马和皮质区Bax/Bcl-2比值显著增加(P<0.05或P<0.01),开心散低、中、高剂量组和阳性药多奈哌齐组可下调Bax/Bcl-2比值(P<0.05或P<0.01)。与正常组相比,模型组小鼠海马和皮质区PSD95、SYN、BDNF的表达水平显著下降(P<0.05或P<0.01),开心散低、中、高剂量组和阳性药多奈哌齐组可不同程度上调PSD95、SYN、BDNF的表达(P<0.05或P<0.01)。(4)试剂盒检测结果提示:和正常组相比,模型组小鼠海马和皮质区AchE的活性明显增加(P<0.05或P<0.01),ChAT的活性明显下降(P<0.05),Ach的水平明显减少(P<0.05或P<0.01),开心散的低、中、高剂量组和阳性药组可不同程度调节上述指标(P<0.05或P<0.01)。和正常组相比,模型组小鼠海马和皮质区SOD(P<0.05)、GSH-Px(P<0.05或P<0.01)明显下降,MDA(P<0.05或P<0.01)和ROS(P<0.01)水平明显升高,开心散的低、中、高剂量组和阳性药多奈哌齐组明显增加SOD、GSH-Px(P<0.05或P<0.01)的活性,降低MDA和ROS(P<0.05或P<0.01)的水平。结论:1.液质联用技术检测出开心散中含5种主要有效成分,为进一步探讨开心散改善认知障碍模型小鼠的学习记忆功能奠定了药效学基础。2.开心散低、中、高剂量可改善认知障碍模型小鼠的学习记忆功能,其发挥作用的机制可能是通过减轻神经元损伤,抗细胞凋亡,改善突触功能,调节胆碱能神经递质,提高抗氧化应激能力而发挥神经保护作用。