【摘 要】
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研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌O157:H7是一种食源性肠道病原菌,可通过粪-口途径传播,导致人体出现腹泻、溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎等病症。该菌主要通过定植肠黏膜导致上皮细胞出现黏附-抹去损伤以及志贺毒素致病。肠出血型大肠埃希菌O157:H7自1982年首次发现以来,在世界各地不定期传播,对人类健康构成巨大威胁。EspF蛋白作为肠出血型大肠埃希菌O157:H7一个关键效应蛋白,在病原菌的致
【基金项目】
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广东省自然科学基金重点项目（2018B030311063）；
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研究背景和目的肠出血型大肠埃希菌O157:H7是一种食源性肠道病原菌,可通过粪-口途径传播,导致人体出现腹泻、溶血性尿毒综合征、出血性结肠炎等病症。该菌主要通过定植肠黏膜导致上皮细胞出现黏附-抹去损伤以及志贺毒素致病。肠出血型大肠埃希菌O157:H7自1982年首次发现以来,在世界各地不定期传播,对人类健康构成巨大威胁。EspF蛋白作为肠出血型大肠埃希菌O157:H7一个关键效应蛋白,在病原菌的致病过程中发挥着重要作用,但对于其具体致病分子机制并不清楚。新近研究发现,该EspF蛋白与宿主细胞内质网存在共定位。本课题主要探索EspF是否靶向定位内质网,继而触发内质网应激反应,最终导致宿主细胞凋亡这一问题,进一步了解EspF诱导细胞死亡的机制,为揭示肠出血型大肠埃希菌O157:H7的致病机制提供科学依据。研究方法（1）EspF蛋白靶向定位宿主细胞内质网研究。利用λRed同源重组系统构建EHEC O157:H7 espF基因缺失株以及回补株,联合EDL933w野生株选择感染HT-29细胞。采用iTRAQ定量技术联合质谱系统,检测胞内蛋白表达水平和调控变化;利用重组质粒EGFP-EspF开展亚细胞定位实验,共同确定EspF蛋白靶向定位内质网。（2）EspF蛋白触发内质网应激反应通路研究。形态学方面,透射电镜观察确定EspF蛋白导致宿主细胞出现内质网应激膨胀病理状态;其次,不同实验组菌株感染处理细胞后,应用实时荧光定量PCR和western blot等技术分别检测应激通路标志分子如BiP、CHOP、Caspase 12等在mRNA和蛋白水平的表达变化情况;利用Fluo-4 AM染色辅助比较钙离子的聚集产生;定性定量研究EspF蛋白所触发内质网应激反应具体信号通路。（3）EspF蛋白诱导宿主细胞凋亡研究。采用Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞术,对各组菌株感染的HT-29细胞凋亡情况进行分析;利用MTT 比色法比较细胞的相对存活率;通过免疫印迹检测细胞Caspase 9/3的表达差异,确定EspF蛋白的存在对EHEC O157:H7致宿主细胞凋亡能力的影响。结果（1）EspF靶向定位宿主细胞内质网。生信筛查可见EspF蛋白使细胞内质网应激相关蛋白表达提升,espF基因缺失减轻内质网应激膨胀现象。（2）EspF蛋白可经PERK、IRE1α、ATF-6通路触发宿主细胞内质网应激反应。espF基因的缺失可导致内质网应激反应相关蛋白表达下调,NF-κB活化和磷酸化降低。（3）EspF蛋白可经Caspase 12特异激活Caspase凋亡反应。espF基因缺失导致HT-29细胞凋亡率降低,相对存活率增高,细胞凋亡蛋白酶12、9和3均表达减少。结论 EHEC O157:H7 EspF蛋白通过靶向定位结合宿主细胞内质网,触发内质网应激反应,最终诱导细胞凋亡。通过本研究,为EHEC O157:H7致病机制提供科学依据。
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