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喹乙醇（Olaquindox）又名喹酰胺醇,具有广谱抗菌作用,能提高饲料蛋白转化率等作用,常被用于饲料添加物,后经研究发现其具有蓄积毒性和致畸等危害,2018年我国农业部发布2638号公告,决定停止喹乙醇等三种兽药在动物食品中使用,因此开发快速、高效、准确的检测方法尤为重要。本文以喹乙醇抗原和单克隆抗体为基础,研究了化学发光体系规律,开发了基于鲁米洛化学发光酶联免疫技术及时间分辨免疫层析技术,并与常规免疫吸附试验和仪器分析方法进行对比和验证,主要研究内容如下:1.喹乙醇单克隆抗体扩大生产与鉴定采用快速融化法对实验室现有3株单克隆杂交瘤细胞复苏,采用体内诱生法大量制备腹水,辛酸-硫酸铵法纯化腹水,得到1#细胞株抗体效价最大为1:3200,并经鉴定单克隆抗体的类型及亚型为IgG1,其IC50为22.013 ng/mL,与其他常用抗生素的交叉反应率均低于0.01%,本部分得到高灵敏性、高特异性的喹乙醇单克隆抗体,为后续免疫分析方法奠定了基础。2.化学发光免疫分析技术本部分建立了luminol-HRP-H2O2-Enhance化学发光体系,通过对四种增强剂的溶解特性及增强效果研究,确定0.02 mol/mL含4%DMSO的Tris-HCl（0.02 mol/L,pH8.5）溶解的4-溴苯酚为增强剂,luminol浓度为1 mmol/L,两者等体积混合后称为A液,30%H2O2稀释500倍后称为B液,通过发光动力学研究,确定检测时间为5min。以最大RLUmax/IC50为优化标准,通过棋盘法确定采用白色发光板以及间接竞争方式,其中包被抗原、抗体的工作浓度为0.94μg/mL和1:4800,在优化条件下竞争反应时间为45 min,HRP酶标羊抗鼠二抗稀释为6000倍,最终对抑制率与加标浓度进行曲线拟合,得到一条“S”型曲线,其IC10=1.446 ng/mL,IC50=14.6 ng/mL,对饲料分别添加低、中、高浓度的OLA标准品,其回收率处于90%105%之间,精密度分析得其变异系数均低于5%,经加标样本检测验证,CLEIA分析与仪器检测结果具有一致性。3.时间分辨荧光免疫层析分析技术本部分研制了时间分辨荧光免疫层析试纸条,采用稀土离子Eu3+标记的喹乙醇单克隆抗体进行示踪,建立间接竞争免疫层析分析方法,其中荧光微球采用EDC/NHS两步法在0.02mol/mL pH5.5 MES缓冲溶液中羧基活化活化40 min后,在0.02 mol/mL pH8.0HEPES溶液中加入等体积60μg/mL的抗体偶联标记3 h。将OLA-HS-BSA和羊抗鼠二抗以1μL/cm划线于NC膜分别作为T线和C线,按照试纸条结构组装检测卡,以T/C值作为优化标准,确定T线和C线包被量为0.4 mg/mL和0.6 mg/mL,偶联微球用量为5μL,免疫层析检测时间和微孔板混合时间分别为15 min和6 min。基于最优的工艺条件,裸眼检测限为4 ng/mL,仪器检测限为2.5 ng/mL,定量检测范围为2.5 ng/mL20ng/mL,其回收率处于90%110%之间,变异系数均低于10%,经加标样本检测验证,荧光免疫层析分析与传统仪器检测结果具有一致性,经50℃加速试验证明其质量稳定,能够保存至少1年。综上,本论文基于免疫反应建立了化学发光免疫分析方法与时间分辨免疫层析分析方法,经鉴定均具有高灵敏度、高准确性、高稳定性等特性,有很大的研究和应用价值。