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背景肿瘤威胁人类健康,有多种方法用于治疗肿瘤。外科手术是治疗肿瘤最古老的方法之一,然而仅仅通过手术,肿瘤往往得不到根治;放化疗杀伤力强,但常常引起消化道反应,肝脏毒性,脱发等副作用,还会使机体免疫力下降,增加肿瘤复发、转移的几率。近年来CAR-T细胞疗法作为一种新的手段引起了人们的关注。但CAR-T细胞在治疗实体瘤的过程中,不但受到T细胞自身免疫抑制作用的影响,而且在肿瘤微环境中CAR-T细胞还很容易耗竭。针对以上的问题,常有研究选择阻断抗体克服T细胞自身的免疫抑制作用,或使用细胞因子刺激细胞来增强功能和改变亚群比例缓解耗竭。免疫检查点和细胞因子往往通过不同机制来影响T细胞功能。因此,通过双功能分子的形式将二者联合应用能够更好地提高CAR-T细胞活性。近年来,双功能分子也是研究热点,多种新型双功能分子被开发用于免疫治疗,他们针对不同的靶点或结合位点发挥各部分功能,往往达到1+1＞2的效果。但在过往的研究中,从未以CAR-T细胞为载体或目标,进行双功能分子的递送,去解决CAR-T细胞治疗实体瘤的问题。因此,在本研究中尝试联合阻断抗体与细胞因子构成双功能分子进一步提升CAR-T细胞功能。PD-1/PD-L1信号通路是重要的T细胞免疫抑制信号通路,本课题选择高亲和力PD1（hafPD1）来阻断PD-1与PD-L1的结合。细胞因子IL-23是由P19和P40两个亚基组成的异二聚体,它可以增强T细胞杀伤活性和持久性,P19亚基在T细胞活化后表达,因此本课题利用P40亚基来构建双功能蛋白f IL-23。首先设计由P40亚基与hafPD1组成的fP40融合蛋白,只有T细胞活化后,fP40才与P19亚基结合,形成人工设计的分泌蛋白f IL-23发挥功能,基于此的fP40过表达CAR-T细胞展示出了良好的肿瘤靶向性,抗肿瘤活性显著提高。综上所述,一方面课题中利用fP40修饰CAR-T细胞,实现一定条件下f IL-23的递送和分泌,在保证安全性的前提下,增强CAR-T细胞功能,对克服实体瘤中CAR-T细胞面临的困境具有重要意义;另一方面研究中首次利用CAR-T细胞作为双功能分子递送的载体和目标,为双功能分子的研发提供了新的思路。方法1、验证在PD-1信号激活与否时,细胞因子对T细胞的功能是否改变。在这里选择PD-L1 Fc蛋白激活PD-1信号,在PD-L1 Fc蛋白存在与否时,用流式细胞术检测T细胞加入细胞因子后,T细胞功能分子的表达、增殖情况等是否改变。2、设计P40亚基与hafPD1的融合蛋白fP40,fP40与T细胞活化后表达的P19亚基组成f IL-23,验证f IL-23的结构和功能。3、构建过表达fP40的CAR276慢病毒质粒,以及作为对比分别构建过表达P40亚基和过表达hafPD1的慢病毒质粒。4、分离培养健康供者外周血CD3+T细胞,经慢病毒感染获得CAR276,CAR276-hafPD1,CAR276-P40,CAR276-fP40四种CAR-T细胞。检测各组CAR-T细胞的杀伤能力和细胞因子的分泌能力。5、CAR-T细胞受到抗原重复刺激后,检测CAR-T细胞的增殖情况、记忆细胞分化能力、细胞功能分子的表达。6、NTG小鼠皮下接种表达荧光素酶报告基因的KYSE150肿瘤细胞,分别构建高剂量CAR-T细胞回输治疗模型和低剂量CAR-T细胞回输治疗模型以及复发模型,利用小动物活体成像仪监测肿瘤的生长情况,统计肿瘤生长曲线和小鼠生存期。7、在高剂量CAR-T细胞回输治疗模型中,研究CAR-T细胞在体内的持久性。在细胞回输治疗后的第10天、第20天、第50天,从小鼠尾尖采集外周血,用CD45和CD3标记CAR-T细胞,并用流式细胞术进行检测。8、C57BL/6J小鼠皮下荷瘤LLC-CD19肿瘤细胞,尾静脉回输CD19靶向CAR-T细胞进行治疗,检测小鼠外周血和脾脏中的免疫亚群比例、检测小鼠血清和肿瘤组织中IL-23的分泌,监测小鼠体重并测量肿瘤大小。结果1、流式结果显示PD-1信号的激活抑制细胞因子对T细胞的作用。IL-23促进T细胞的增殖、记忆表型的分化、功能因子的表达,在PD-1信号激活时,IL-23不再促进T细胞的增殖能力、细胞记忆表型的分化和功能分子的表达。IL-7、IL-15具有促进T细胞增殖的作用,在PD-1信号激活时,IL-7、IL-15不再促进T细胞的增殖。IL-12和IL-18促进T细胞IFN-γ的分泌,在PD-1信号激活时,IL-12和IL-18不再促进T细胞IFN-γ的分泌。2、在中国仓鼠卵巢细胞中将表达P19亚基和表达fP40亚基的质粒按摩尔比1:1进行瞬时转染,收集转染上清后利用尺寸排阻色谱进行蛋白纯化,得到纯化蛋白f IL-23。将f IL-23在非还原和还原条件下进行电泳和蛋白质印迹实验,分析融合蛋白f IL-23是由fP40和P19亚基组成的异二聚体,并通过流式细胞术证明了f IL-23在PD-1信号激活时也能增强T细胞增殖、记忆分化能力和CD107a、IFN-γ、Granzyme B等功能分子的表达。3、制备的CAR276细胞、CAR276-hafPD1细胞、CAR276-P40细胞、CAR276-fP40细胞中,CAR276-fP40细胞杀伤能力和IL-23、IL-2、IFN-γ等细胞因子的分泌能力明显增强。4、在抗原重复刺激模型中,与CAR276细胞、CAR276-hafPD1细胞、CAR276-P40细胞相比,CAR276-fP40细胞的增殖能力,中心记忆细胞的分化能力明显增强,细胞脱颗粒功能明显增强,IL-2、IFN-γ、Granzyme B等细胞毒性分子的表达也明显提高。5、用NTG小鼠构建人源肿瘤细胞系异种移植模型,并给予小鼠高剂量CAR-T细胞进行治疗。CAR276细胞、CAR276-hafPD1细胞、CAR276-P40细胞、CAR276-fP40细胞以及CAR276细胞联合f IL-23尾静脉回输治疗,利用小动物活体成像仪监测肿瘤大小并统计肿瘤生长曲线和小鼠生存期。和其他组相比,CAR276-fP40细胞控制肿瘤的能力明显增强,小鼠生存期也有所延长,且明显优于CAR276细胞联合f IL-23治疗组,这说明双功能分子通过CAR-T细胞进行递送的治疗效果要优于CAR-T细胞与双功能分子全身给药联合治疗的效果。6、在高剂量CAR-T细胞回输模型中,通过流式细胞术检测CD45+CD3+T细胞的比例,代表各组CAR-T细胞在体内的持久性。第10天、第20天、第50天的结果都说明,与CAR276细胞、CAR276-hafPD1细胞、CAR276-P40细胞以及CAR276细胞联合f IL-23相比,CAR276-fP40细胞在体内的持久性最强。7、在上述高剂量CAR-T细胞回输模型的基础上,进一步构建复发模型,研究在复发模型中各组CAR-T细胞的抗肿瘤效果,利用小动物活体成像仪监测肿瘤大小并统计肿瘤生长曲线和小鼠生存期。结果显示,和CAR276细胞、CAR276-hafPD1细胞、CAR276-P40细胞以及CAR276细胞联合f IL-23治疗组相比,CAR276-fP40细胞在复发模型中也能发挥更强的抗肿瘤效果,且小鼠的生存期也明显延长。8、在低剂量CAR-T细胞回输模型中,通过小动物活体成像仪监测肿瘤大小并统计肿瘤生长曲线和小鼠生存期。实验结果证明,与CAR276细胞、CAR276-hafPD1细胞、CAR276-P40细胞以及CAR276细胞联合f IL-23治疗组相比,CAR276-fP40细胞在低剂量CAR-T细胞回输模型中也能发挥更强的抗肿瘤效果,且小鼠的生存期也明显延长。9、通过LLC-CD19细胞构建免疫正常小鼠的肿瘤模型,并给予CD19靶向CAR-T细胞进行治疗,我们观察到相比于m CAR19细胞、m CAR19-hafPD1细胞、m CAR19-P40细胞,m CAR19-fP40细胞在免疫正常小鼠模型中发挥更强的抗肿瘤作用,在肿瘤组织中IL-23的局部浓度明显增强,且通过监测免疫亚群和小鼠体重证明了m CAR19-fP40细胞安全性良好。结论本课题中构建的双功能分子f IL-23说明,将阻断抗体与细胞因子以融合蛋白的形式结合,不但可以增强T细胞的增殖、活化等功能,还能克服免疫抑制作用,不受PD-1/PD-L1抑制信号的影响;除此之外,以CAR-T细胞作为载体和目标,进行双功能分子和融合蛋白的递送,大大提高了CAR-T细胞的功能,增强了CAR-T细胞对肿瘤的控制作用且安全性良好。以上研究为双功能分子的递送,提供了新的思路,并为克服CAR-T细胞在实体瘤中的困境,提供了新的解决办法。