【摘 要】
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番茄白粉病的发生随着番茄栽培面积的扩大也日益严重,严重影响了番茄的产量和品质。植物MLO基因家族中的部分成员是白粉病的感病因子,MLO基因发生的隐性突变mlo可赋予植物对白粉病菌广谱抗性,在抗病育种中发挥极其重要的作用。课题组前期研究结果显示SlMLO4为番茄感白粉病相关基因,但目前关于白粉菌胁迫下番茄酵母cDNA文库的构建以及SlMLO4互作蛋白的研究鲜见报道。本研究以感白粉病番茄品种‘Mone
【基金项目】
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国家自然科学基金地区科学基金项目“番茄SlMLO4参与白粉菌胁迫应答的机制研究”(31860561);
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番茄白粉病的发生随着番茄栽培面积的扩大也日益严重,严重影响了番茄的产量和品质。植物MLO基因家族中的部分成员是白粉病的感病因子,MLO基因发生的隐性突变mlo可赋予植物对白粉病菌广谱抗性,在抗病育种中发挥极其重要的作用。课题组前期研究结果显示SlMLO4为番茄感白粉病相关基因,但目前关于白粉菌胁迫下番茄酵母cDNA文库的构建以及SlMLO4互作蛋白的研究鲜见报道。本研究以感白粉病番茄品种‘Moneymaker(MM)’和抗白粉病番茄自交系‘62579’为材料,筛选出番茄在白粉菌胁迫下qRT-PCR中最稳定的内参基因,对MM番茄SlMLO4基因受白粉菌诱导后不同时间点的表达谱进行研究,并以接种O.neolycopersici后SlMLO4基因表达量最高时间点的MM番茄叶片为材料,通过gateway方法构建核体系及膜体系番茄酵母cDNA文库,利用酵母双杂交技术筛选膜体系番茄酵母cDNA文库,在NCBI网站对阳性质粒测序结果进行Blast比对分析,筛选出与SlMLO4互作的候选靶蛋白,再挑选部分候选靶蛋白通过酵母回转试验进行初步验证。研究结果如下:1、综合geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件分析结果,番茄在白粉菌胁迫下的较稳定内参基因为L33和EF1α。针对感白粉病番茄MM,Act和GAPDH为较稳定内参基因;针对抗白粉病番茄62579,较稳定内参基因为Act、EF1α和L33。2、番茄MM在O.neolycopersici诱导下SlMLO4基因表达谱研究表明:SlMLO4基因在O.neolycopersici诱导后72 h表达量达到最高,约为0 h的2.5倍。3、以接种白粉菌0 hpi、6 hpi和72 hpi的MM番茄叶片为材料,通过gateway方法构建番茄酵母cDNA文库,初级文库总库容为1.2×107CFU,重组率为100%,平均插入片段长度大于1000 bp;通过LR重组反应构建核次级文库及膜次级文库,核次级文库总库容为1.6×107 CFU,重组率为100%,平均插入片段长度大于1000 bp;膜次级文库总库容为1.04×107 CFU,重组率为100%,平均插入片段长度大于1000 bp;初级及次级文库均达到文库质检标准,可以用于酵母双杂交筛库试验。4、质粒测序结果证明,pBT3-STE-SlMLO4诱饵载体构建成功,无移码突变。诱饵载体自激活检测及功能验证结果显示,诱饵蛋白在NMY51酵母菌中可以正确表达,并且不存在自激活性,即构建的诱饵载体功能验证通过,可以用于酵母双杂交筛库试验。5、酵母双杂交筛选番茄膜体系酵母cDNA文库,获得了 26个可能与SlMLO4互作的候选靶蛋白,这些候选靶蛋白大部分定位在叶绿体或质膜上,只有glycine-rich cell wall structural protein定位在细胞壁上、12-oxophytodienoate reductase 1定位在细胞质中。另外,以上大部分候选靶蛋白都含有跨膜螺旋结构,数量为1-11个不等。6、酵母回转验证结果显示,60S ribosomal protein L18a-like protein 和 PLAT domain-containing protein 2 与 SlMLO4 互作存在假阳性可能,初步确定 vacuolar-sorting receptor 1-like isoform X1、sodium/calcium exchanger NCL、K(+)efflux antiporter 2、Golgi SNAP receptor complex member 1-2、SEC12-like protein 1、ATP synthase I-like protein、V-type proton ATPase 16 kDa proteolipid subunit、glycine-rich cell wall structural protein、photosystem Ⅱ subunit S 和 tetraspanin-19 共 10 个靶蛋白与SlMLO4存在互作。上述研究结果为进一步确定SlMLO4基因与靶蛋白基因的调控关系、探索其与靶蛋白基因在番茄与白粉菌互作过程中的响应机制奠定理论基础,同时为番茄的广谱抗性育种提供理论依据。
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