研究背景:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的消化道肿瘤之一,也是世界上最致命的恶性肿瘤之一,位居全球第四大常见死亡原因,对人类健康构成了巨大威胁。近几十年来,随着对结直肠癌发病机制的深入研究,发现了越来越多的治疗靶点,但其疗效仍有限。因此,有必要探索影响结直肠癌发病机制和致癌因素的新机制,以便实施有效的预防措施和改进治疗。在结直肠癌患者中,约40%会发生Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（kirsten rats arcomaviral oncogene homolog,KRAS）突变,KRAS基因是抗表皮生长因子受体治疗不可或缺的生物标志物,被认为是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）生物治疗耐药的预测基因。结直肠癌是第一批引入靶向治疗（抗EGFR抗体）的癌症类型之一,但抗EGFR单克隆抗体仅仅对野生型KRAS（wt KRAS）癌患者有效,而对突变型KRAS（mtKRAS）癌患者耐药。西妥昔单抗（cetuximab）是一种抗EGFR单克隆抗体,现主要用于wt KRAS转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer,mCRC）患者治疗,但只有不到一半的wt KRAS mCRC患者对抗EGFR治疗有反应,而其余部分会对其治疗产生耐药。说明KRAS突变不是抗EGFR治疗耐药的全部因素。有研究发现,与只发生KRAS突变相比,发生KRAS和磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α（phosphoinositide 3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA）双突变的CRC患者,呈现出更强的侵袭性及较差的总生存期,耐药程度增加,PIK3CA突变是抗EGFR单克隆抗体治疗mCRC患者（尤其是KRAS野生型患者）耐药的一个生物标志物。提示西妥昔单抗对CRC治疗的影响,可能与KRAS突变是否同时伴有PI3KCA突变相关。另外,目前普遍的观点认为抗EGFR治疗对KRAS突变的mCRC患者治疗无反应。然而有研究发现携带KRAS G13D突变的肿瘤相对于KRAS G12V突变,对肿瘤细胞的生长和肿瘤进展的影响更小,对抗EGFR抗体治疗也更敏感。细胞实验发现KRAS G13D突变结肠癌细胞株LoVo细胞对西妥昔单抗治疗呈现一定的的敏感性。这表明在目前普遍认为KRAS突变患者对抗EGFR单克隆抗体治疗耐药的情况下,其实存在部分KRAS突变亚型的肿瘤患者或者肿瘤细胞株表现出对抗EGFR单克隆抗体治疗有一定的敏感性。如果我们能够找到引起该KRAS突变亚型对抗EGFR单克隆抗体治疗发生反应的原因及分子机制并加以干预,无疑会在一定程度上拓展抗EGFR单克隆抗体的使用范畴,改善部分KRAS突变患者的治疗效果。腺苷二磷酸-核糖基化（ADP-ribosylation）是将单个或多个ADP核糖转移到受体蛋白特定氨基酸位点的一种可逆的、位点特异性的翻译后修饰。在细胞中,它能够由白喉毒素样ADP核糖基转移酶（the diphtheria toxin-like ADP-ribosyltransferases,ARTDs）催化,以及被ADP核糖基化水解酶逆转。在人类健康和疾病过程中,ADP核糖基化与基因转录、染色质重构等关键生物学过程相关。目前关于ADP核糖基化的研究,主要是基于对ADP核糖基化相关酶进行探讨。本课题组前期研究显示,在结直肠癌中,抑制聚ADP核糖基化作用可以抑制癌细胞的恶性生物学行为,但上调此作用,不能获得回复性效果;进一步研究结果显示,结直肠癌聚ADP核糖基化作用受到单ADP核糖基化作用制约。因此,课题组前期对单ADP核糖基化在结直肠癌中的作用进行了一些研究。研究结果显示,精氨酸特异性单ADP核糖转移酶1（arginine-specific mono-ADP-ribosyltransferase 1,ART1）可以参与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,Akt,PKB）/核因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase,Erk）/Akt/微管蛋白β3（tubulin beta 3,Tubb3）、聚ADP核糖基化聚合酶1（poly（ADP-ribose）polymerase-1,PARP-1）-肝激酶B1（liver kinase B1,LKB1）-腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）等信号通路的调控,进而促进结直肠癌的进展。众所周知,EGFR信号通路下游主要有RAS/鼠类肉瘤滤过性毒菌（V-raf）致癌同源体（V-raf murine sarcoma viral oncogene homologue,RAF）/丝裂原活化蛋白激酶激酶（mitogen-activated protein kinase kinase,MEK）/细胞外信号调节激酶（extracellular-signalregulated protein kinase,ERK）/有丝分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、PI3K/Akt（PKB）/mTOR两大信号通路。由此可见,单ADP核糖基化可能参与EGFR信号通路的调控。因此,我们推测单ADP核糖基化也可能会影响抗EGFR单克隆抗体治疗效果。组蛋白是ADP核糖基化的靶点之一,且组蛋白ADP核糖基化修饰的主要形式是单ADP核糖基化。本课题组前期研究确认在KRAS G13D突变结肠癌LoVo细胞中组蛋白H3的第117精氨酸（H3R117）是一个单ADP核糖基化位点。将该位点突变,构建的H3R117A突变LoVo细胞,与野生型LoVo细胞（LoVo WT）相比,细胞增殖、侵袭、转移能力降低。通过转录组测序（RNA-seq）发现,与LoVo WT相比,H3R117A突变LoVo细胞的基因表达谱发生改变。突变前后的差异基因（DEGs）主要影响“染色质结构和动力学”。其中spty2d1（spt2）是突变后表达下降的基因之一。根据功能富集基因ontolog（Go）分析,只有spt2与parp10富集在“染色质组装的调控”（regulation of chromatin assembly）的生物学过程（biological process）中。Parp10是一种细胞内单ADP核糖基化转移酶,具有催化目标蛋白形成单ADP核糖基化的作用。Spt2是一种具有独立HMG（high-mobility group）样结合域的组蛋白伴侣蛋白。Spt2能够与H3/H4四聚体直接结合,在核小体重组过程中,通过RNA聚合酶II来维持H3/H4四聚体的完整性,并在转录过程中维持H3/H4四聚体的功能。若spt2缺失,H3/H4四聚体将脱离DNA,分解成H3/H4二聚体。Spt2还可以延长RNA聚合酶II,通过降低核小体密度来改变染色质结构,进而调节组蛋白-DNA的相互作用,对DNA转录和修复发挥重要调节功能。因此,我们推测,spt2与单ADP核糖基化在染色质功能的维系中可能相互作用。课题组前期研究发现,parp10能够通过促进β-连环蛋白（β-catenin）的表达及核转入而促进结直肠癌细胞增殖。此外,RNA-seq发现,LoVo WT与H3R117A突变LoVo细胞之间有显著差异的基因多个富集于糖胺聚糖生物合成-硫酸软骨素/皮肤碱硫酸盐途径,并且突变以后细胞β-catenin表达降低,细胞迁移、侵袭能力减弱。但是详细机制并不清楚。有研究表明,存在于细胞表面的硫酸软骨素/硫酸皮肤素蛋白聚糖与Wnt相互作用,导致β-catenin表达增加,从而影响肿瘤转移。β-catenin是细胞核中经典Wnt信号通路,也称为Wnt/β-catenin信号通路的关键核效应因子。大量研究表明β-catenin在KRAS G13D突变型结肠癌对西妥昔单抗耐药中具有重要作用。转录因子7类似物2（the transcription factor 7-like 2,TCF7L2）是Wnt/β-catenin信号通路的主要转录共激活因子,参与了西妥昔单抗治疗mCRC发生耐药的过程。TCF7L2在细胞核内,与β-catenin结合形成TCF7L2/β-catenin复合物,激活Wnt/β-catenin信号通路调控癌细胞增殖,相关信号通路能正向调控肿瘤中的有氧糖酵解,促进肿瘤进展。那么,组蛋白H3R117单ADP核糖基化,是否能够通过spt2调节西妥昔单抗对结直肠癌细胞增殖能力的影响,这是本研究首先想要解决的问题。其次,我们想要进一步探讨在该过程中,组蛋白H3R117单ADP核糖基化是否通过Wnt/β-catenin信号通路来实现对肿瘤细胞有氧糖酵解的调控,以及在该过程中是否对西妥昔单抗调控LoVo细胞的增殖产生影响。本研究旨在为提高结直肠癌临床治疗效果提供新的思路和初步实验依据。研究方法:本研究分为三个部分。一、H3R117单ADP核糖基化对西妥昔单抗调控KRAS突变结直肠癌增殖的影响1.采用CCK8检测西妥昔单抗对三种KRAS突变结直肠癌细胞即SW480（KRAS G12V不伴PI3KCA突变）、HCT116（KRAS G13D伴有PI3KCA突变）、LoVo（KRAS G13D不伴PI3KCA突变）存活率的影响。2.采用CCK8检测间碘苄基胍（MIBG）抑制单ADP核糖基化对西妥昔单抗调控三种KRAS突变结直肠癌细胞即SW480（KRAS G12V不伴PI3KCA突变）、HCT116（KRAS G13D伴有PI3KCA突变）、LoVo（KRAS G13D不伴PI3KCA突变）存活率的影响。3.采用Ed U检测MIBG抑制单ADP核糖基化对西妥昔单抗调控三种KRAS突变结直肠癌细胞即SW480（KRAS G12V不伴PI3KCA突变）、HCT116（KRAS G13D伴有PI3KCA突变）、LoVo（KRAS G13D不伴PI3KCA突变）增殖能力的影响。4.采用Western blotting检测三种KRAS突变结直肠癌细胞即SW480（KRAS G12V不伴PI3KCA突变）、HCT116（KRAS G13D伴有PI3KCA突变）、LoVo（KRAS G13D不伴PI3KCA突变）组蛋白H3单ADP核糖基化水平。5.采用细胞克隆实验检测MIBG抑制单ADP核糖基化作用对西妥昔单抗调控两种KRAS突变结直肠癌细胞即LoVo（KRAS G13D不伴PI3KCA突变）、SW480（KRAS G12V不伴PI3KCA突变）增殖能力的影响。6.采用Western blotting检测将H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后LoVo细胞中组蛋白H3单ADP核糖基化水平。7.采用CCK8、流式及克隆形成实验检测将LoVo细胞中H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后对西妥昔单抗调控KRAS G13D LoVo细胞增殖能力的影响。8.采用裸鼠皮下移植瘤模型检测将LoVo细胞中H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后对西妥昔单抗调控KRAS G13D LoVo细胞移植瘤生长的影响。二、H3R117单ADP核糖基化对KRAS G13D突变结直肠癌spt2的影响1.采用Western blotting及q PCR检测将LoVo细胞中H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后对spt2在LoVo（KRAS G13D）细胞中表达的影响。2.采用琼脂糖磁珠免疫沉淀（IP）检测spt2与组蛋白H3在LoVo（KRAS G13D）细胞中是否相互作用及H3R117单ADP核糖基化对该作用的影响。3.采用细胞免疫荧光检测MIBG及将LoVo细胞中H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后对西妥昔单抗调控spt2表达的影响。4.采用免疫组化检测spt2在人结直肠癌组织中的表达情况。5.采用Western blotting检测LoVo细胞中spt2的敲低效率。6.采用CCK8检测敲低spt2后对LoVo细胞存活率的影响。7.采用流式检测敲低spt2后对LoVo细胞周期及凋亡的影响。三、H3R117单ADP核糖基化引起的spt2变化对Wnt/β-catenin信号通路及其下游PDK1、LDHA等糖酵解酶的影响1.采用cBio Portal及Gene Expression Profiling Interactive analysis（GEPIA）在线结直肠癌数据库数据对spt2进行生物信息学分析。2.采用Western blotting检测H3R117 MARylation对KRAS G13D LoVo细胞TCF7L2及β-catenin蛋白表达的影响,q PCR检测TCF7L2m RNA的变化。3.采用染色质免疫共沉淀（CHIP）检测H3R117 MARylation对KRAS G13D LoVo细胞TCF7L2启动子H3K56乙酰化水平的影响。4.采用乳酸及ATP检测试剂盒检测H3R117 MARylation对KRAS G13D LoVo细胞ATP及乳酸生成的影响。5.采用Western blotting检测H3R117 MARylation对KRAS G13D LoVo细胞糖酵解相关酶及细胞增殖相关基因的表达的影响。6.采用Western blotting检测H3R117 MARylation对KRAS G13D LoVo细胞移植瘤中糖酵解相关酶及细胞增殖相关基因表达的影响。研究结果:一、H3R117单ADP核糖基化对西妥昔单抗调控KRAS突变结直肠癌存活率的影响1.CCK8结果显示,西妥昔单抗处理后,整体上三种细胞对西妥昔反应的敏感度均较低。同时存在KRAS和PIK3CA突变的HCT116细胞存活率在三种细胞中受到的抑制作用最小。2.CCK8结果显示,MIBG联合西妥昔单抗使HCT116、SW480、LoVo三组细胞存活率均低于对照组和单独使用西妥昔单抗组（P＜0.05）。其中LoVo细胞存活率下降最明显。3.Ed U结果显示,MIBG联合西妥昔单抗使HCT116、SW480、LoVo三组细胞增殖力均低于对照组和单独使用西妥昔单抗组（P＜0.05）。4.Western blotting结果显示,在HCT116、LoVo、SW480三种不同亚型的KRAS突变结直肠癌细胞中,HCT116细胞组蛋白H3的单ADP核糖基化（MARylation）水平最低;与HCT116相比,LoVo最高（P＜0.05）;SW480组蛋白H3的MARylation水平介于LoVo及HCT116之间。5.细胞克隆实验结果显示,与对照组相比,单独使用西妥昔单抗,LoVo（KRAS G13D）细胞和SW480（KRAS G12V）细胞的克隆形成效率几乎无影响;西妥昔单抗联合MIBG处理后,LoVo细胞和SW480细胞的克隆形成效率均明显降低（P＜0.05）,而且LoVo细胞的克隆形成效率比SW480降低更明显。6.Western blotting结果显示,与对照组相比,将H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后,H3R117A突变细胞中组蛋白H3单ADP核糖基化水平降低（P＜0.05）。7.将LoVo细胞中H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后促进西妥昔单抗对KRAS G13D LoVo细胞增殖的抑制作用。7.1CCK8结果显示,与LoVo WT相比,西妥昔单抗对H3R117A LoVo细胞存活率抑制性更强（P＜0.05）。7.2流式细胞术检测细胞周期结果显示,与LoVo WT相比,西妥昔单抗处理后,H3R117A LoVo细胞在G1期阻滞（P＜0.05）。7.3克隆形成实验结果显示,与LoVo WT相比,西妥昔单抗处理H3R117A LoVo细胞后,克隆形成效率降低（P＜0.05）。8.裸鼠皮下成瘤实验结果显示,H3R117A组的移植瘤瘤重量低于LoVo WT组,西妥昔单抗治疗在H3R117A组更有效（P＜0.05）。二、H3R117单ADP核糖基化对KRAS G13D突变结直肠癌spt2的影响1.Western blotting及q PCR结果显示,与对照组相比,spt2在H3R117A LoVo细胞中蛋白及m RNA水平均降低（P＜0.05）。2.琼脂糖磁珠免疫沉淀（IP）结果显示,spt2与组蛋白H3之间存在相互作用。将LoVo细胞中H3R117具单ADP核糖基化的精氨酸位点突变后,能够降低spt2与组蛋白H3之间的相互作用。3.细胞免疫荧光显示,LoVo细胞中,spt2定位在细胞核。与LoVo WT组相比,单独使用西妥昔单抗,对LoVo细胞spt2荧光表达强度无影响;西妥昔单抗联合MIBG处理后,LoVo细胞spt2荧光表达强度明显降低（P＜0.05）。与H3R117A相比,西妥昔单抗处理H3R117A LoVo细胞后,spt2荧光表达强度降低（P＜0.05）。4.免疫组化结果显示,spt2在结直肠癌和切缘组织中均有表达;在细胞核和细胞质中也均有表达。核表达主要分布于高分化结直肠癌及切缘组织。胞质和胞核同时表达主要分布于中分化和低分化结直肠癌。与相应的切缘组织相比,结直肠癌组织中spt2水平明显升高（P＜0.05）。临床病理特征分析显示,spt2表达水平与性别、年龄、部位无关;但与TNM分期有关。与直肠腺癌（rectum adenocaroma,READ）相比,spt2强阳性（+++）表达在结肠腺癌（colon adenocaroma,COAD）中与侵润深度相关性更强。5.Western blotting结果显示,与LoVo WT相比,spt2敲低效率最高的靶区为SPTY2D1-homo-432（P＜0.05）,后续采用SPTY2D1-homo-432作为实验组（SPT2-sh RNA）。6.CCK8结果显示,与对照组相比,敲低spt2后,在24h、48h、72h测得LoVo细胞存活率均降低。但在24h,spt2敲低后,LoVo细胞存活率的降低与对照组相比无统计学意义;在48h及72h,LoVo细胞存活率的降低与对照组相比有统计学意义（P＜0.05）。7.流式结果显示,与对照组相比,spt2敲低的LoVo细胞在G1期的比例增加,G2+S期的比例降低,呈现G1期阻滞（P＜0.05）;此外,spt2敲低的LoVo细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。三、H3R117单ADP核糖基化引起的spt2变化对Wnt/β-catenin信号通路及其下游PDK1、LDHA等糖酵解酶的影响1.spt2生物信息学分析结果显示,使用cBio Portal在线数据库检查spt2在结直肠癌中的基因改变类型显示,深度缺失（deep deletion）是CRC中spt2基因改变之一;此外,CRC中spt2突变（mutation）频率最高,扩增（amplification）频率最低。spt2在CRC中拷贝数有改变（copy number changes,CNA）。spt2在与细胞增殖相关的途径中与TCF7L2相关。使用GEPIA中CRC数据库评估spt2在结直肠癌中的表达显示,在COAD和直肠腺癌READ中的表达均高于配对正常组织。2.Western blotting结果显示,与LoVo WT相比,H3R117A突变LoVo细胞组中,TCF7L2及β-catenin表达均降低（P＜0.05）;q PCR结果显示,TCF7L2在H3R117A突变LoVo细胞中m RNA降低（P＜0.05）。LoVo WT和空载组LoVo细胞之间TCF7L2及β-catenin表达差异无统计学意义。3.染色质免疫共沉淀（CHIP）结果显示,与LoVo WT相比,H3R117A细胞中TCF7L2启动子富集的H3K56ac减少（P＜0.05）。4.乳酸及ATP检测结果显示,与LoVo WT及空载转染组相比,H3R117A LoVo细胞培养液中乳酸产生量和细胞中ATP含量均明显降低（P＜0.05）。5.Western blotting结果显示,与LoVo WT或空载转染组LoVo细胞相比,H3R117A LoVo细胞中PDK1、LDHA、c-Myc和cyclin D1的表达下降（P＜0.05）;LoVo WT和空载转染组之间无明显差异;不同组之间的PKM2蛋白水平无明显差异。6.Western blotting结果显示,与移植LoVo WT瘤体相比,移植H3R117A成瘤组织中PDK1、LDHA、c-Myc和cyclin D1的表达略微下降;而在西妥昔单抗治疗后,与移植LoVo WT瘤体相比,H3R117A成瘤组织中PDK1、LDHA、c-Myc和cyclin D1的表达明显下降（P＜0.05）。研究结论:1.H3R117单ADP核糖基化能够拮抗西妥昔单抗对KRAS G13D突变结直肠癌的增殖抑制作用。2.H3R117单ADP核糖基化能够促进KRAS G13D突变结直肠癌spt2的表达。3.H3R117单ADP核糖基化通过对spt2表达的调控,影响TCF7L2的转录,进而通过Wnt/β-catenin信号通路作用其下游靶基因,调控其表达,包括增加糖酵解相关酶,如PDK1、LDHA;细胞增殖相关蛋白,如c-Myc、cyclin D1的表达,促进肿瘤有氧糖酵解水平及细胞增殖能力,进而降低对西妥昔单抗的治疗敏感性。因此,抑制H3R117单ADP核糖基化可能为克服KRAS G13D结直肠癌西妥昔单抗耐药的联合新靶点,有必要深入研究。