本试验以野生型拟南芥基因组DNA为模板,通过PCR反应分别克隆了AtCBF1和AtCBF3的全长基因,然后分别将其插入克隆载体pMD18-T中,并分别转入大肠杆菌DH5α菌株中保存。经测序检测后,两个目的基因分别被插入到植物表达载体pCAMBIA 1304中位于CaMV 35S启动子和Nos终止子间的Nco I和Bgl II酶切位点间,分别构建AtCBF1和AtCBF3的植物表达载体,然后分别将两个表达载体转入农杆菌EHA105中。为了建立狗牙根高效的愈伤诱导体系,我们采用L16(43)的均匀正交设计,对NAA、6-BA和2,4-D三种生长调节剂的浓度进行了优化。通过极差分析和方差分析,同时结合他人的实验数据,确定了狗牙根愈伤组织诱导的最优培养基为:2,4-D 2.0mg/L+BA0.1 mg/L+NAA 2mg/L。愈伤组织在愈伤诱导培养基上继代培养2周后可形成致密的淡黄色愈伤组织,转入不定芽分化培养基(MS培养基+ 3mg/L 6-BA+4mg/L KT),进行光培养,可分化出绿色的不定芽,诱导率为100%。不定芽在生根培养基(MS培养基+0.3mg/L NAA)诱导不定根,诱导率可达100%。百子莲的体细胞再生体系由试验室的另一位同学建立。为了确定转化试验中潮霉素的筛选浓度,我们设计了百子莲抗生素敏感性试验。在百子莲的分化培养基和生根培养基中分别添加不同浓度的潮霉素(0,5mg/L,10mg/L,15mg/L,20mg/L和25mg/L)。根据百子莲的胚性愈伤组织和不定芽在这些培养基中的生长状况,分别统计了死亡率和生根率,从而最后确定了百子莲愈伤分化和幼苗生根的潮霉素筛选浓度分别为20 mg/L和15 mg/L。狗牙根的筛选浓度根据文献确定为5 mg/L。利用农杆菌介导法转化百子莲和狗牙根的胚性愈伤组织,在不含抗生素的愈伤继代培养基中暗培养5至7天后,分别转入含有20mg/L和5mg/L潮霉素的分化培养基上进行筛选。待分化出不定芽后,将其分别转入含有15mg/L和5mg/L潮霉素的生根培养基上进行筛选。