目的溶酶体膜通透化(Lysosomal membrane permeabilization,LMP)可导致酸性蛋白酶的外泄,从而启动细胞凋亡、以及凋亡样和坏死样细胞死亡,其过程有多种蛋白酶及信号通路参与。然而肿瘤细胞溶酶体的变异使得癌细胞具有维持溶酶体膜稳定性的能力,从而避免LMP的发生。若某种药物可诱导肿瘤细胞的LMP,则其可能成为治疗肿瘤的有效药物。因此靶向溶酶体膜通透化可能成为肿瘤治疗的一种新指标,同时可以避免单一靶向治疗肿瘤的弊端。由于溶酶体内为酸性环境,p H值为5左右,LMP可导致质子外泄,导致溶酶体膜周围酸化。因此可以利用绿色荧光蛋白在酸性环境中荧光会消失,而红色荧光在酸性环境中并无明显变化的这种特性来检测LMP的发生。根据这一特性,本实验拟构建及鉴定串联荧光报告基因(tandem EGFP-m RFP fluorescent reporter)标记溶酶体膜蛋白(Lamp-2c)的真核表达载体并观察其在前列腺癌PC3细胞中的表达情况。评价串联荧光载体p Lamp2c-EGFP-m RFP在溶酶体中的定位情况,以期该载体可以用于检测溶酶体通透化。为后续研究靶向溶酶体膜通透化的药物筛选奠定基础。方法本实验包括两部分:1.设计并构建串联荧光报告基因(tandem EGFP-m RFP fluorescent reporter)标记溶酶体膜蛋白(Lamp2c)的真核表达载体p Lamp2c-EGFP-m RFP。为增强目的蛋白及荧光蛋白的表达,我们在Lamp-2c前增加Kozak序列,考虑到Lamp2c表达后仍需表达EGFP及m RFP,在引物的设计中去除Lamp2c的终止密码子。通过PCR、酶切、测序验证Lamp2c基因构建情况;2.利用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent转染系统将p Lamp-2c-EGFP-m RFP质粒载体转染入体外培养的PC3细胞,并观察红绿荧光的表达情况。通过含Lyso Tracker?Blue DND-22浓度为50n M的培养基处理PC3细胞溶酶体,于共聚焦显微镜下观察,评价p Lamp-2c-EGFP-m RFP表达产物在溶酶体中定位情况。结果1.经过PCR、酶切、测序鉴定,证明p Lamp-2c-EGFP-m RFP真核表达载体构建成功;2.通过X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent转染系统将p Lamp-2c-EGFP-m RFP瞬时转染至PC3细胞系,EGFP及m RFP均正常表达,但红色荧光相对于绿色荧光较弱;3.利用Lyso Tracker?Blue DND-22处理转染p Lamp-2c-EGFP-m RFP后的PC3细胞,蓝色荧光与红色荧光及绿色荧光定位相同。结论成功构建了p Lamp-2c-EGFP-m RFP真核表达载体,体外转染PC3细胞后能够稳定表达Lamp2c、EGFP及m RFP蛋白,并且通过共定位分析,证明Lamp2c成功定位于溶酶体上,并且表达红绿荧光蛋白。根据以上结果证明该载体构建成功,并且可用于检测溶酶体,为后续进一步研究LMP与肿瘤的治疗的关系奠定了基础。