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第一部分D-半乳糖诱导大鼠内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡目的：线粒体DNA (mitochondrial DNA,mtDNA)的氧化性损伤和凋亡是老化的重要特征。我们之前利用连续8周注射D-半乳糖(D-galactose, D-gal)的方法建立了大鼠老化模型,并且发现在D-gal诱导的老化大鼠内耳中氧化性应激的增加和mtDNA常见缺失(common deletion, CD)的增加。但是,在D-gal诱导的老化大鼠内耳中,目前没有直接的证据表明mtDNA CD的累积是由氧化性损伤引起的；同时此模型内耳中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的来源以及凋亡情况仍不清楚。方法：听力正常,无中耳疾患的40只5周龄雄性Spragua-Dawley大鼠随机分成2组(各20只)：①D-半乳糖组(D-gal group):每日颈背部皮下注射D-gal (500mg/kg),连续8周；②对照组(control group):每日颈背部皮下注射同体积的生理盐水,连续8周。听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)检测每组大鼠听功能。比色法检测大鼠血清H202,总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活性以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量。实时定量PCR检测大鼠内耳mtDNA CD的累积以及NADPH氧化酶3(NOX3)和P22phox]mRNA水平的变化。透射电子显微镜检术(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察大鼠内耳组织细胞中线粒体超微结构的改变。免疫组织化学法检测大鼠耳蜗8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHdG)以及NOX3和P22phox蛋白水平的变化。免疫印迹法检测大鼠内耳组织中激活型caspase-3(cleaved caspase-3)的表达。原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end-labelling, TUNEL染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡发生的情况。结果：D-半乳糖组大鼠血清H202和MDA含量比对照组明显增加,T-SOD水平比对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。D-半乳糖组大鼠内耳组织中mtDNACD累积比对照组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。TEM发现D-半乳糖组大鼠耳蜗组织细胞中线粒体表现为基质密度降低,甚至发生严重变性。D-半乳糖组大鼠耳蜗组织中8-OHdG、NOX3、P22phox和cleaved caspase-3的表达比对照组明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL染色发现少量凋亡细胞局限于D-半乳糖组大鼠耳蜗血管纹,而对照组大鼠耳蜗未发现凋亡细胞。两组大鼠ABR阈值差异无统计学意义(P>0.05)。结论：在内耳老化过程中mtDNACD的积累可能是NADPH氧化酶相关的氧化性应激造成的,并且caspase-3介导的细胞凋亡可能参与了内耳的老化过程。第二部分长期高脂饮食加重D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳氧化性应激,线粒体损伤和凋亡目的：研究12个月的高脂饮食对Sprague-Dawley大鼠内耳及D-半乳糖诱导的老化大鼠内耳的老化过程的作用。方法：104只5周龄雄性Spragua-Dawley大鼠随机分成4组(各26只)：①对照组(control group):饲喂基础饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射和D-半乳糖组同体积的生理盐水；②D-半乳糖组(D-gal group):饲喂基础饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射D-gal (500mg/kg);③高脂饮食组(HFD group):饲喂高脂饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射和D-半乳糖组同体积的生理盐水；④D-半乳糖+高脂饮食组(D-gal+HFD group):饲喂高脂饮食12个月,前8周每日颈背部皮下注射D-gal (500mg/kg)。造模结束后,听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)检测每组大鼠听功能；每组大鼠称重,比色法检测大鼠血清甘油三脂(triglycerides,TG),总胆固醇(total cholesterol, TC),游离脂肪酸(nonesterified fatty acids, NEFA)和H202含量；实时定量PCR检测大鼠内耳mtDNACD的累积以及NADPH氧化酶3(NOX3), P22phox, uncoupling protein2(UCP2)和uncoupling protein3(UCP3) mRNA水平的变化；免疫组织化学法检测大鼠耳蜗NOX3蛋白水平的表达；免疫印迹法检测大鼠内耳组织中NOX3,P22phox,UCP2,UCP3和激活型caspase-3(cleaved caspase-3)的蛋白水平的表达；透射电子显微镜检术(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察大鼠耳蜗血管纹边缘细胞线粒体超微结构的改变；原位末端转移酶标记(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick-end-labelling, TUNEL染色检测大鼠耳蜗细胞凋亡情况。结果：D-半乳糖组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠ABR阈值在4,8,16和32kHz比对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05)；高脂饮食组大鼠ABR阈值数值上在上述4个频率均比对照组升高,但仅在32kHz差异有统计学意义(P<0.05)；同时,D-半乳糖+高脂饮食组大鼠ABR阈值在16和32kHz比D-半乳糖组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清TG、TC和NEFA水平比对照组和D-半乳糖组升高,差异有统计学意义(P<0.01)；D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清H202水平比对照组升高,差异有统计学意义(P<0.01),其中D-半乳糖+高脂饮食组大鼠血清H202水平最高,差异有统计学意义(P<0.01)。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠内耳组织NOX3、P22phox、UCP2、UCP3和cleaved caspase-3的表达比对照组升高,其中D-半乳糖+高脂饮食组最高,差异有统计学意义(P<0.01)。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠内耳组织mtDNA CD的累积比对照组增加,差异有统计学意义(P<0.05)。D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组大鼠耳蜗血管纹边缘细胞线粒体有不同程度的肿胀,伴有线粒体基质密度降低。TUNEL染色发现D-半乳糖组、高脂饮食组和D-半乳糖+高脂饮食组凋亡细胞比对照组明显增多,且凋亡细胞主要局限于血管纹；同时,在D-半乳糖+高脂饮食组大鼠耳蜗Corti器发现少量凋亡细胞。结论：长期高脂饮食可诱导内耳氧化性应激、线粒体损伤和凋亡。长期高脂饮食可加速年龄相关性听力损失的进展。