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刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种在细胞内寄生的机会性致病原虫,可感染包括人在内的几乎所有的温血动物,严重威胁人及动物健康。近年的研究发现,病原微生物感染会诱导宿主细胞编码RNA及非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）的显著差异表达,nc RNA可通过调控宿主细胞的生物学功能参与多种病原体与宿主的相互作用过程。T.gondii裂解周期（lytic cycle）包括虫体吸附、入侵、纳虫泡形成、复制和细胞裂解5个过程,研究T.gondii在裂解周期中对宿主nc RNA表达的影响,将有助于深入理解宿主抗T.gondii感染及T.gondii操纵宿主细胞利于其胞内生存的机制。本研究以T.gondii感染人包皮成纤维（human foreskin fibroblast,HFF）细胞为模型,利用RNA-seq技术分析了裂解周期中的T.gondii对HFF细胞信使RNA（messenger RNA,m RNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）、环状RNA（circular RNA,circRNA）和小分子RNA（micro RNA,miRNA）表达的影响,并利用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）、双荧光素酶报告基因试验、免疫印迹（Western Blot）和腺病毒包装等试验方法,探究了显著下调的miR-142-3p和miR-146a-5p在T.gondii感染中的调控机制,获得了如下研究结果:1.明确了裂解周期中的T.gondii对HFF细胞m RNA表达的影响:T.gondii在感染HFF细胞1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h时,分别诱导了636个、1266个、1843个、2303个、3022个、1757个、3088个和2531个m RNA的显著差异表达,并有103个差异表达的m RNAs（differentially expressed m RNAs,DEmRNAs）在整个裂解周期中均差异表达;对所有DEmRNAs进行GO富集分析发现,它们主要富集于宿主与病原互作的生物学过程;KEGG分析发现,所有DEmRNAs主要富集于免疫相关信号通路和神经退行性疾病相关通路。2.明确了裂解周期中的T.gondii对HFF细胞lncRNA表达的影响:T.gondii在感染HFF细胞1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h时,分别诱导697个、1234个、1499个、873个、1466个、561个、676个和716个lncRNA的显著差异表达,并有28个差异表达的lncRNAs（differentially expressed lncRNAs,DElncRNAs）在整个裂解周期中均差异表达;对所有DElncRNAs的靶基因进行GO富集分析发现,它们主要富集于DNA重组、逆转录酶参与RNA介导的转位和核酸磷酸二酯键水解等重要的生物学过程;对所有DElncRNAs的靶基因进行KEGG分析发现,它们主要富集于自噬通路和线粒体自噬通路。3.明确了裂解周期中的T.gondii对HFF细胞circRNA表达的影响:T.gondii感染HFF细胞1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h时,分别诱导757个、1536个、2621个、5076个、6294个、11014个、7819个和8142个的circRNA显著差异表达,并有26个差异表达的circRNAs（differentially expressed circRNAs,DEcircRNAs）在整个裂解周期中均差异表达;对所有DEcircRNAs的来源基因进行GO富集分析发现,它们主要富集于细胞过程、代谢过程和生物调节等重要的生物学过程;对所有DEcircRNAs的来源基因进行KEGG分析发现,它们主要富集在免疫相关通路和代谢相关通路。4.明确了裂解周期中的T.gondii对HFF细胞miRNA表达的影响:T.gondii感染HFF细胞1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、36 h和48 h时,分别诱导了16个、26个、60个、68个、106个、154个、221个和230个的miRNA显著差异表达,并有5个差异表达的miRNAs（differentially expressed miRNAs,DEmiRNAs）在整个裂解周期中均差异表达;对所有DEmiRNAs的靶基因进行GO富集分析发现,它们主要富集于RNA聚合酶II对转录的正向调控、细胞分化和多细胞生物的发展等重要的生物学过程;对所有DEmiRNA的靶基因进行KEGG分析,发现它们主要富集于代谢相关通路。5.解析了miR-142-3p在T.gondii感染中的调控机制:选取显著下调表达的miR-142-3p进行了进一步研究,其预测靶基因CLIC4的m RNA水平在T.gondii感染HFF细胞0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h时均显著上调表达;双荧光素酶报告基因试验发现miR-142-3p能够抑制CLIC4的转录活性;利用腺病毒包装技术成功构建了过表达和抑制miR-142-3p表达的腺病毒,过表达miR-142-3p抑制CLIC4在m RNA和蛋白水平的表达,而抑制miR-142-3p的表达对CLIC4的作用相反,表明miR-142-3p与CLIC4之间存在靶向关系;过表达miR-142-3p可以抑制Bcl-2蛋白的表达,促进Bax蛋白表达及促进Caspase3和FASL的m RNA表达水平,而抑制miR-142-3p的表达对Bcl-2、Bax蛋白表达以及Caspase3和FASL的m RNA表达水平的作用相反。这些结果表明,T.gondii感染抑制HFF细胞中miR-142-3p的表达,但促进CLIC4的表达,进而抑制凋亡信号通路。6.解析了miR-146a-5p在T.gondii感染中的调控机制:miR-146a-5p在T.gondii感染HFF细胞0 h、6 h、12 h、24 h、36 h和48 h时均显著下调表达,其预测靶基因TRAF6的m RNA水平在T.gondii感染HFF细胞0 h、6 h、12 h、24h、36 h和48 h时均显著上调表达;双荧光素酶报告基因试验发现miR-146a-5p能够抑制TRAF6的转录活性;利用腺病毒包装技术成功构建了过表达和抑制miR-146a-5p表达的腺病毒,过表达miR-146a-5p抑制TRAF6在m RNA和蛋白水平的表达,而抑制miR-146a-5p的表达对TRAF6的作用相反,表明miR-146a-5p与TRAF6之间存在靶向关系;过表达miR-146a-5p可以抑制p65和及NF-κB信号通路下游基因IL-1α、IL-4和TNF-α的表达,而抑制miR-146a-5p的表达对p65和IL-1α、IL-4和TNF-α的作用相反。这些结果表明,T.gondii感染抑制HFF细胞中miR-146a-5p的表达,促进靶基因TRAF6的表达,进而激活NF-κB信号通路。综上所述,本研究初步揭示了裂解周期中的T.gondii对宿主细胞基因表达的影响,解析了宿主细胞miR-142-3p和miR-146a-5p在T.gondii感染中的调控作用,研究结果为进一步深入理解T.gondii感染与宿主细胞之间的相互作用提供了新思路。