【摘 要】
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冷鲜猪肉营养丰富,在生产流通中易受细菌污染,其加工链中潮湿且富含营养的器具表面为微生物繁殖和生物膜的形成提供了良好环境。细菌形成生物膜后对环境的适应性变强,不仅引起肉类腐败变质和产品交叉污染,还会造成食源性疾病传播和食物中毒。假单胞菌是引起冷鲜猪肉腐败变质的优势腐败菌之一,荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌在低温条件下可以迅速生长繁殖,具有较强的生物膜形成能力,对冷鲜猪肉产品安全是一种潜在的威胁。研究采用
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冷鲜猪肉营养丰富,在生产流通中易受细菌污染,其加工链中潮湿且富含营养的器具表面为微生物繁殖和生物膜的形成提供了良好环境。细菌形成生物膜后对环境的适应性变强,不仅引起肉类腐败变质和产品交叉污染,还会造成食源性疾病传播和食物中毒。假单胞菌是引起冷鲜猪肉腐败变质的优势腐败菌之一,荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌在低温条件下可以迅速生长繁殖,具有较强的生物膜形成能力,对冷鲜猪肉产品安全是一种潜在的威胁。研究采用试管和置片相结合的培养方法、结晶紫染色定量生物膜方法,探究4℃、15℃和26℃下冷鲜猪肉中混合菌群在玻璃和不锈钢表面生物膜形成规律。采用宏基因组测序技术分析成膜微生物的多样性,同时进行生理生化鉴定和16S rRNA测序技术分离鉴定成膜微生物,96微孔板法筛选强成膜能力细菌。实时荧光定量PCR技术检测假单胞菌相关基因表达与生物膜形成的相关性。为预防和控制冷鲜猪肉生产中细菌生物膜污染提供理论依据和指导,对提高冷鲜猪肉品质及卫生安全有重要的意义。研究结果如下:（1）冷鲜猪肉的淋洗液菌群浓度为10~5CFU/mL进行成膜试验,4℃、15℃和26℃下,细菌生物膜分别在第7 d、4 d和0.5 d达到成熟期。不同温度下,不锈钢材质表面形成的生物膜量大于玻璃材质,且生物膜形成量具有显著性差异（p＜0.05）。（2）平板分离纯化从冷鲜猪肉混合菌群生物膜中分离鉴定到大肠杆菌、哈夫尼菌、柠檬酸杆菌和假单胞菌等22株具有强生物膜形成能力的细菌,其中优势菌为大肠杆菌和哈夫尼菌。宏基因组技术微生物多样性分析共检测到61种成膜细菌,优势菌种有盐单胞菌、假单胞菌和不动杆菌,三者丰度可达90%以上。15℃下生物膜从12 h到24 h的形成过程中,假单胞菌的丰度快速上升了53.6%,占显著优势。同时分离筛选出三株具有强成膜能力的假单胞菌。（3）试验筛选到强成膜能力的荧光假单胞菌进行成膜研究。4℃、15℃和26℃下,随温度升高荧光假单胞菌生物膜形成量减少。不锈钢材质表面生物膜形成量不同温度下分别在第8 d、3 d和12 h达到峰值;玻璃表面生物膜不同温度下分别在第10 d、4 d和0.5 d达到成熟期。（4）实时荧光定量PCR技术检测假单胞菌游离和成膜状态下相关基因表达。分别收集26℃,12h的游离和成膜细胞进行定量PCR,检测生物膜形成相关基因rpoZ（RNA聚合酶基因）、algR（藻酸盐基因）和lapA（粘附素基因）,群体感应基因ppuR,内参基因atpC。假单胞菌成熟生物膜中的lapA、algR、rpoZ和ppuR基因的表达量显著上升,且不同的成膜材质表面对相关基因的表达量具有显著影响。（5）RT-qPCR技术检测假单胞菌和变形杆菌混合成膜状态相关基因表达。收集混合细胞进行定量PCR,检测rpoZ、algR、lapA、ppuR基因（内参基因atpC）。与假单胞菌单菌相比,混合菌中假单胞菌在游离和成膜状态下的lapA、algR和rpoZ基因的表达量显著下降,而ppuR基因具有不同表达结果。
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