【摘 要】
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目的:确定ATF6α（Activating transcription factor 6α）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）细胞中的功能作用;确定ATF6α特异性抑制剂Ceapin-A7对HCC细胞体内外功能的作用;初步探索ATF6α调控HCC细胞功能的潜在生物学机制。方法:利用ATF6α特异性小干扰RNA（si ATF6）,HBLV-h-ATF6sh RNA
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目的:确定ATF6α（Activating transcription factor 6α）在肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）细胞中的功能作用;确定ATF6α特异性抑制剂Ceapin-A7对HCC细胞体内外功能的作用;初步探索ATF6α调控HCC细胞功能的潜在生物学机制。方法:利用ATF6α特异性小干扰RNA（si ATF6）,HBLV-h-ATF6sh RNA1-Zs Green-PURO慢病毒（sh ATF6）和小分子化合物Ceapin-A7对HCC细胞系中的ATF6α信号转导进行特异性抑制,并采用RT-q PCR和Western blot技术进行m RNA和蛋白水平的验证;通过CCK-8活力实验、细胞增殖实验、细胞克隆/悬浮实验和细胞迁移侵袭实验等验证ATF6α特异性敲低和Ceapin-A7对HCC细胞体外功能的作用;Western blot验证Ceapin-A7对ATF6α信号的体内外抑制作用;构建HCC异种移植小鼠模型,灌胃给予Ceapin-A7,验证Ceapin-A7对HCC细胞功能的体内作用;对si ATF6处理的Hep G2细胞进行转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）,并进行基因富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）和KEGG通路分析,富集受ATF6α调控显著的信号通路,并采用RT-q PCR和Western blot进行基因和蛋白水平的验证。结果:首先,在GEO（Gene Expression Omnibus）和TCGA（the Cancer Genome Atlas）数据库中对HCC患者进行数据挖掘发现与癌旁组织相比ATF6 m RNA表达水平在HCC患者肿瘤中上调,并且随着HCC分期进展,ATF6 m RNA表达水平增加。此外,与正常肝细胞L02相比,在三种HCC细胞系Hep RG、Hep G2和Huh7中,ATF6α蛋白水平表达上调。CCK-8活力实验、增殖实验、克隆悬浮实验和侵袭迁移实验显示,在对HCC细胞系中的ATF6α信号转导进行特异性抑制后,HCC细胞的活力、增殖速度、克隆和悬浮生长能力以及侵袭迁移能力均受到了一定水平的抑制。然后,药理学和安全性评价显示,在小鼠体内Ceapin-A7具有良好的药理学活性与安全性。最后,对si RNA处理的Hep G2细胞进行转录组测序以及对差异基因进行富集分析发现,ATF6α通过调控蛋白分泌途径支持HCC发生发展。结论:ATF6α在HCC中高表达并且与疾病进展密切相关,遗传学或药理学抑制ATF6α表达可以有效遏制HCC细胞在体内外的功能。机制上,ATF6α可能通过影响HCC细胞的蛋白分泌组从而促进肿瘤的发展。
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