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目的:多壁碳纳米管（multi-walled carbon nanotubes,MWCNTs）作为一种典型的纳米材料,具有独特的结构和优越的物理性能,在工业生产和医学领域被广泛应用,但其对机体的毒性作用也备受关注。尽管目前流行病学证据还不足,但动物、体外细胞实验已证实其具有呼吸系统毒性,可诱导肺纤维化以及肺部肿瘤等。自噬为细胞维持自身稳态的重要过程,研究表明其功能障碍与上述肺部疾病的发生发展密切相关。MWCNTs已在多项研究中被证实可以对自噬产生影响,可以诱导细胞自噬的过度激活或自噬流阻滞从而引发细胞功能障碍,但其具体的分子机制仍不清楚。Circular RNA HECTD1（circHECTD1）是一种在免疫系统中具有多种功能的circRNA,可对细胞自噬产生影响,同时也被证实可以促进肺泡巨噬细胞的激活以及参与肺纤维化过程。本研究以人支气管上皮BEAS-2B细胞为研究对象,研究MWCNTs对BEAS-2B细胞自噬的影响及circHECTD1在其中的作用,为更好地解明MWCNTs的毒性及其作用机制提供科学依据。方法:使用0μg/cm~2、0.25μg/cm~2、1μg/cm~2、4μg/cm~2、16μg/cm~2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞24 h,CCK-8实验检测细胞存活率。使用Western blot检测MWCNTs染毒影响自噬相关蛋白LC3II和p62表达水平的浓度—效应和时间—效应关系,其中染毒浓度梯度设置为0μg/cm~2、0.25μg/cm~2、1μg/cm~2、4μg/cm~2,时间点设置为0 h、6 h、12 h、24 h、48 h。自噬双标腺病毒m RFP-GFP-LC3转染BEAS-2B细胞2 h后使用4μg/cm~2MWCNTs染毒24 h,共聚焦显微镜下观察自噬流水平。溶酶体抑制剂氯喹预处理细胞3 h后使用4μg/cm~2的MWCNTs处理24 h,检测LC3II蛋白的表达水平。使用4μg/cm~2的MWCNTs处理细胞24 h后通过溶酶体红色荧光探针Lysotracker red染色2 h,荧光显微镜下观察溶酶体p H的变化。分别使用random primer或oligo（dt）primer进行逆转录,或使用RNase R消化总体RNA,q RT-PCR检测circHECTD1的表达水平,进行circHECTD1的环化验证。使用q RT-PCR检测MWCNTs染毒影响circHECTD1表达水平的浓度—效应和时间—效应关系,其中染毒浓度梯度设置为0μg/cm~2、0.25μg/cm~2、1μg/cm~2、4μg/cm~2,时间点设置为0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h。转染circHECTD1过表达腺病毒6 h后使用4μg/cm~2的MWCNTs处理BEAS-2B细胞24 h,Western blot检测LC3II和p62蛋白表达水平;转染m RFP-GFP-LC3观察过表达circHECTD1对染毒后BEAS-2B细胞自噬流的影响;通过Lysotracker red染色观察过表达circHECTD1对染毒后BEAS-2B细胞溶酶体p H的影响。结果:1.MWCNTs对BEAS-2B细胞活力的影响:与对照组相比,MWCNTs染毒24 h后,1μg/cm~2、4μg/cm~2和16μg/cm~2浓度组细胞活力均显著降低（P＜0.01）,且呈剂量—效应关系。其中16μg/cm~2浓度组的细胞活力降低至70%以下。2.MWCNTs染毒对BEAS-2B细胞自噬流的作用:（1）随着染毒浓度的升高,LC3Ⅱ和p62蛋白表达也逐渐升高,在MWCNTs浓度为4μg/cm~2时,LC3Ⅱ和p62的表达均显著升高（P＜0.01）;LC3Ⅱ和p62的表达在染毒24 h及48 h后显著升高（P＜0.01）。（2）转染m RFP-GFP-LC3后,MWCNTs染毒组与对照组相比,黄色荧光点增多。（3）氯喹处理BEAS-2B细胞后,LC3Ⅱ表达显著增加,继续使用MWCNTs处理细胞后,LC3Ⅱ的表达没有进一步增加。以上结果表明MWCNTs诱导BEAS-2B细胞发生自噬流阻滞。3.MWCNTs对BEAS-2B细胞溶酶体p H的影响:Lysotracker red染色后在荧光显微镜下可观察到MWCNTs染毒组与对照组相比,红色荧光显著减弱。表明MWCNTs染毒使BEAS-2B细胞溶酶体p H升高。4.BEAS-2B细胞中circHECTD1的环化验证:使用RNase R消化总RNA后,circHECTD1的表达无变化;与逆转录过程中使用oligo（dt）primer时,与random primer相比检测到circHECTD1的表达量降低（P＜0.01）。5.MWCNTs染毒对BEAS-2B细胞中circHECTD1表达的影响:染毒浓度为4μg/cm~2,染毒时间为24、48及72 h时,circHECTD1的表达显著下降（P＜0.01）。6.过表达circHECTD1对MWCNTs诱导的BEAS-2B细胞自噬流阻滞的作用:在MWCNTs处理的BEAS-2B细胞中过表达circHECTD1后,LC3Ⅱ和p62蛋白表达显著降低（P＜0.05）,且通过双标腺病毒标记观察到的黄色荧光点减少。以上结果表明过表达circHECTD1可缓解MWCNTs诱导的细胞自噬流阻滞。7.过表达circHECTD1对MWCNTs染毒的BEAS-2B细胞溶酶体p H的影响:在MWCNTs染毒的BEAS-2B细胞中过表达circHECTD1后,Lysotracker red染色显示红色荧光强度有所恢复,表明过表达circHECTD1能够降低溶酶体p H。结论:MWCNTs能够诱导BEAS-2B细胞发生自噬流阻滞;MWCNTs诱导的自噬流阻滞与溶酶体p H升高有关;MWCNTs暴露降低BEAS-2B细胞中circHECTD1的表达水平,进而引起溶酶体p H升高,这可能是MWCNTs诱导BEAS-2B细胞自噬流阻滞的原因之一。