【摘 要】
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蓝舌病是经吸血库蠓传播的非接触性虫媒病毒病,其病原是呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）。作为我国的一类动物疫病,蓝舌病具备传染性强、病死率高、媒介分布广、易感动物多、血清型丰富、跨境传播频繁的特征,对全球畜牧业造成大量损失,需完善该病流行病学资料,建立通用诊断技术并研发广谱高效疫苗。云南地处我国西南边陲,与东南亚接壤,是我国BTV血清型最为丰富的省份,炎热
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蓝舌病是经吸血库蠓传播的非接触性虫媒病毒病,其病原是呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）。作为我国的一类动物疫病,蓝舌病具备传染性强、病死率高、媒介分布广、易感动物多、血清型丰富、跨境传播频繁的特征,对全球畜牧业造成大量损失,需完善该病流行病学资料,建立通用诊断技术并研发广谱高效疫苗。云南地处我国西南边陲,与东南亚接壤,是我国BTV血清型最为丰富的省份,炎热潮湿的气候环境、繁多的动物贸易、滋生的媒介库蠓给蓝舌病的传播蔓延提供了适宜条件。本研究旨在对我国云南边境地区牛群中BTV的分子流行病学展开调查,明确当前牛源BTV的感染状况、优势血清型、进化变异情况。同时,对云南边境地区库蠓源BTV进行分离和遗传进化分析,以及库蠓携带的病毒开展宏基因组学分析,掌握库蠓传播病毒的本底、种类多样性和分子亲缘关系,为蓝舌病的有效防控和库蠓源新发再发病毒病的预警奠定基础。本研究主要结果如下:（1）为明确BTV在我国云南边境地区的流行状况,对2018～2019年和2021年间,云南边境7城市共计2259份牛血液样品进行BTV监测。BTV在云南边境地区牛群中的总阳性率为17.00%,横向上看,不同边境城市的牛BTV阳性率为13.26%～20.65%;纵向上看,边境城市牛BTV阳性率从2018年11.86%逐年上升至2021年的23.22%。结果表明,云南边境7个城市的牛源BTV感染率维持在较高水平且有上升的趋势。为进一步研究BTV的进化情况,对部分血液样品进行S10基因的扩增,共获得了28个BTV S10基因序列。核苷酸同源性在81.2%～100%,与BTV东方地域型国家的标准毒株最为相近。（2）为掌握BTV在云南边境地区的分子流行病学特征,对牛源BTV接种鸡胚进行扩毒,共收获5株BTV毒株。S2基因PCR进行BTV血清型的鉴定,2株BTV-1型分别于保山（2019年）、普洱（2021年）分离获得,1株BTV-2型于普洱（2019年）分离获得,1株BTV-16型于德宏（2021年）分离获得,1株BTV-21型于西双版纳（2019年）分离获得。为进一步研究BTV S2基因的遗传变异情况,对云南边境地区BTV的S2基因进行了同源性比对,结果表明云南边境BTV毒株与我国已报道的相应血清型毒株同源性最高;氨基酸序列比对发现保山毒株、普洱毒株和普洱思茅毒株VP2蛋白的氨基酸突变位点涉及到抗原表位;S2基因遗传进化分析表明,5株BTV分离株均与我国毒株处在一个进化分支,分子亲缘关系相近。上述结果,为理解蓝舌病的流行态势、疫苗适配、跨境传播路线和遗传变异规律提供参考。（3）为了解库蠓携带病毒丰度,将库蠓研磨液接种至昆虫细胞,反复盲传,共获得3株病毒。S2基因PCR进行BTV血清型的鉴定,其中2株（于2020年在德宏采集）鉴定为BTV-16型。2株库蠓源BTV的S2基因同源性和进化分析表明,2株毒株均与我国BTV-16型毒株及主要的西方地域型毒株分子亲缘关系较近。病毒组学结果显示,库蠓源病毒主要属于黄病毒科、披膜病毒科、楚病毒科、逆转录病毒科、疱疹病毒科等共计7个病毒科。选取代表性虫媒病毒楚病毒进行糖蛋白编码基因的分子亲缘分析,结果表明本研究获得的楚病毒序列与已报道的同种病毒序列同源性高,并聚成一个进化分支。生物信息学预测结果表明,楚病毒GUTV糖蛋白可能为亲水蛋白、具有跨膜结构、无信号肽、亚细胞定位至细胞核或质膜、存在72个潜在的磷酸化位点和10处抗原表位。本研究还对逆转录病毒科的PERV建立了PERV SYBR Green I qPCR检测方法,该方法敏感性高、重复性好、特异性强,便于临床样品的检测。以上结果,为研究基因组层次的库蠓源BTV对反刍动物源的适应性进化机制,以及库蠓源病毒分子溯源、致病性分析和疾病预警提供支持。
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