基因的游离表达较整合表达操作更简单,但许多工业菌株因没有游离质粒,而严重影响着菌株的改造,特别是外源基因的表达。产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株有多重抗逆性能和优秀发酵性能的自主知识产权工业菌株,是潜在的工业合成生物学底盘细胞,但是该菌株无天然游离质粒,且二倍体整合操作繁琐复杂,影响了深层次的合成代谢改造。本课题旨在建立C.glycerinogenes的游离表达体系,并应用于游离表达合成咖啡酸与香叶醇,主要研究内容包括:（1）探索构建C.glycerinogenes的游离质粒,利用不同酵母菌株来源的自主复制序列（ARS）构建了以GAPp、GFP、AOX1t和URA5分别为启动子、报告基因、终止子和筛选标记基因的共10个游离质粒,并考察所构建游离质粒在C.glycerinogenes中的转化效率、荧光表达强度、拷贝数以及菌体内存在状态等性能,结果表明,来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）质粒p YX212的212ARS、乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis）的pan ARS、毕赤酵母（Pichia pastoris）的PPARS1和PPARS2以及东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）的IOARS在C.glycerinogenes中有自主复制能力,可用于C.glycerinogenes中游离质粒的构建,其中pan ARS所构建的游离质粒p TGAPp-GFP-AOX1t-pan ARS-URA5的表达性能最强,且不影响菌株耐受性能,质粒稳定性测试表明菌株第十五代时该质粒丢失率仅9%,具有较高质粒稳定性。（2）为进一步提高所获得游离质粒p TGAPp-GFP-AOX1t-pan ARS-URA5的性能,对其不同结构组件进行了优化,研究表明,不同的内源诱导启动子和不同来源终止子均可成功表达外源基因GFP,其中GAPp调控强度最大,URA5t终止效率最高;在GFP起始密码子两侧添加Kozak序列,可有效提高荧光表达强度;当URA5启动子截短250 bp时,能增加质粒拷贝数从而提高GFP的表达水平;通过不同策略优化使用ARS,发现pan ARS位于目的基因表达元件上游时对外源基因表达最有益,双ARS策略表明pan ARS与PPARS2联用可提高质粒拷贝数,此外,利用pan ARS与IOARS成功在C.glycerinogenes中构建了双游离质粒表达系统。（3）为评估研究获得的游离质粒在C.glycerinogenes中的实际应用性能,考察了游离质粒表达外源基因的效果,研究表明,成功游离表达合成咖啡酸的通路基因TAL、HPAB和HPAC,咖啡酸产量最高达29.1 mg·L-1;利用游离质粒表达合成香叶醇的外源基因Cr GES,香叶醇产量最高达23.2 mg·L-1。应用结果进一步证明了所构建的C.glycerinogenes的游离表达体系的有效性,为今后C.glycerinogenes的研究和合成生物学改造提供了新的分子操作工具,同时为其他无游离质粒菌株构建游离表达体系提供了参考。