【摘 要】
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提高玉米单位面积产量是解决目前我国玉米总产不足最有效的措施;粒重是玉米单位面积产量的重要决定因素之一,因此,克隆控制玉米粒型和粒重的关键基因,深入解析玉米籽粒发育调控的分子机制具有重要的理论意义和应用价值。本研究以EMS诱变获得的玉米粒型突变体smk7（small kernel 7）为材料,采用BSA-seq定位和图位克隆的方法分离了一个影响玉米籽粒发育的基因ZmRPC2,并解析了其控制玉米籽粒发
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提高玉米单位面积产量是解决目前我国玉米总产不足最有效的措施;粒重是玉米单位面积产量的重要决定因素之一,因此,克隆控制玉米粒型和粒重的关键基因,深入解析玉米籽粒发育调控的分子机制具有重要的理论意义和应用价值。本研究以EMS诱变获得的玉米粒型突变体smk7（small kernel 7）为材料,采用BSA-seq定位和图位克隆的方法分离了一个影响玉米籽粒发育的基因ZmRPC2,并解析了其控制玉米籽粒发育的分子机制,获得的主要研究结果如下:1.smk7的表型观察与遗传学分析:与野生型相比,smk7突变体胚和胚乳发育滞后,成熟籽粒的粒长减小10.07%（p-value＜0.001）、粒宽减小11.70%（p-value＜0.001）、粒厚减小19.38%（p-value＜0.001）,百粒重减小30.05%（p-value＜0.001）。通过细胞学观察发现,突变体籽粒基部转运层（BETL）细胞没有明显的细胞壁堆叠,中央胚乳细胞（CSE）中淀粉粒（SG）和蛋白体（PB）积累缓慢,但成熟籽粒的质地没有变化。遗传分析表明该粒型突变体为一个隐性核基因突变后产生的。2.ZmSmk7的定位克隆:采用BSA-seq的方法将目的基因定位在6号染色体一个80 Mb区间内,之后使用4300个突变体,结合图位克隆的方法定位克隆到目的基因Zm00001d035960,其编码RNA聚合酶Ⅲ的第二个亚基,将其命名为ZmRPC2（The second-largest subunit of RNA polymerase III in maize）。对其进行序列分析发现,在突变体中该基因第36个外显子上剪切识别位点处的一个单碱基变异（SNP）导致其第36个内含子不能正常剪切,成熟m RNA中有26 bp的内含子保留,从而导致其编码的氨基酸序列移码和提前终止。3.ZmRPC2的功能验证:利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对候选基因ZmRPC2进行编辑,得到3个在ZmRPC2上存在变异的突变体,3个突变体都具有籽粒发育缺陷表型;而且这3个突变体与smk7杂交不能恢复smk7突变体籽粒的表型,由此证实了ZmRPC2为smk7的目的基因。4.ZmRPC2调控玉米籽粒发育分子机制的解析:通过酵母双杂和双分子荧光互补实验发现,ZmRPC2能够与RNA聚合酶Ⅲ的第四个亚基RPC53、第11个亚基AC40、转录起始因子TFⅢC的亚基TFC1以及其调控因子FL3互作,从而控制RNA聚合酶Ⅲ对下游小分子RNA的转录。其突变后胚乳中5s r RNA和多种t RNAs的表达量都下调50%以上,多个与DNA复制和细胞周期相关的基因出现差异表达,从而导致胚乳细胞增殖和多倍化受阻,胚乳细胞数量大量减少,籽粒变小。5.ZmRPC2与FL3的互作分析:ZmRPC2和胚乳发育关键调控因子FL3都具有影响RNA聚合酶Ⅲ转录活性的功能且这两个基因编码的蛋白直接互作,将smk7和fl3杂交构建双基因突变体;在此基础上发现FL3突变以后ZmRPC2的表达量升高了112.76%,从而弥补了部分fl3籽粒发育缺陷表型,致使其籽粒大小与野生型没有显著差异,由此说明ZmRPC2对于FL3具有补偿效应;但smk7和fl3对玉米胚乳细胞增殖及籽粒百粒重的影响具有叠加效应,smk7;fl3相较于smk7胚乳大小和粒重显著减小;以上的结果表明FL3和ZmRPC2共同控制RNA聚合酶Ⅲ转录活性从而控制玉米胚乳细胞的增殖和籽粒的发育。进一步分析发现,在fl3中大量与蛋白质的合成、转运、加工、修饰及分解相关的基因表达量下调,醇溶蛋白合成减少,非醇溶蛋白合成增加,成熟籽粒表现粉质胚乳表型;而在smk7中这些基因表达量没有变化,醇溶蛋白和非醇溶蛋白的合成没有变化,成熟籽粒表现为硬质胚乳表型;由此说明ZmRPC2不具有调控醇溶蛋白合成的功能,FL3执行对醇溶蛋白合成调控的功能可能是通过其他的途径实现的。
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