随着城市工业化进展加速,空气污染对居民健康构成严重威胁。其中细颗粒物（particulate matters 2.5,PM2.5）吸附有害物质多,在空气中悬浮时间长,对人体的影响最大。PM2.5暴露可以使呼吸系统疾病恶化,显著增加哮喘和慢性阻塞性肺疾病等慢性病患者的住院率和死亡率。气道高反应性（airway hyperresponsiveness,AHR）是指呼吸道对非抗原性刺激敏感性增加,可表现出过强过早的支气管平滑肌收缩反应,从而引起气道狭窄与气道阻力增加。AHR作为哮喘患者的重要特征,在一定程度上与哮喘的严重程度呈正相关。关于PM2.5诱发哮喘加重的分子机制主要集中在炎症反应、氧化应激、免疫系统失衡、细胞凋亡、自噬及表观遗传学改变等方面,但是其具体的分子机制仍然不清。溴结构域蛋白4（BRD4）是溴结构域蛋白（BET）家族的成员,在整个有丝分裂过程中始终结合在染色体上,可以通过招募包括Mediator、正性转录延伸因子b（P-TEFb）在内的多种转录调节因子,进而调控多种靶基因的表达,此外,BRD4还参与了RNA聚合酶II介导的基因转录,在调节炎症反应、氧化应激和细胞周期等生物过程中均发挥着至关重要的作用。关于BRD4与哮喘的关系中,目前主要集中在刺激炎症因子的释放和促进气道重塑这两个方面。本研究的目的在于探讨BRD4在PM2.5诱发气道高反应中的作用并揭示其可能的分子机制。实验分为三部分:第一部分为动物实验部分,用PM2.5多功能气溶胶浓缩富集系统对不同组小鼠进行为期12周的PM2.5暴露,观察PM2.5对小鼠气道反应性的影响,同时给予药物ZL0420（BRD4特异性抑制剂）,探讨BRD4在此过程中的作用。第二部分为气道平滑肌细胞收缩实验部分,我们将提纯的PM2.5粉末溶于DMSO配置成母液,通过0.22μm滤网过滤,然后按照比例用培养基稀释成不同浓度,作用于气道平滑肌细胞24小时,观察PM2.5能否通过BRD4影响气道平滑肌细胞的收缩并探讨其具体的分子调控机制。第三部分为气道平滑肌细胞迁移实验部分,我们将提纯的PM2.5粉末溶于DMSO配置成母液,通过0.22μm滤网过滤,然后按照比例用培养基稀释成不同浓度,作用于气道平滑肌细胞24小时,观察PM2.5能否通过BRD4影响气道平滑肌细胞的迁移功能。第一部分PM2.5通过促进BRD4的表达增强小鼠的气道高反应目的:观察PM2.5暴露是否可以通过溴结构域蛋白4调控小鼠的气道高反应。方法:1.试验动物分组及暴露方案:40只6-7周雄性C57小鼠（SPF级）,在实验开始前适应实验室环境一周。然后被随机分为4组:清洁空气组（FA组）,PM2.5组,PM2.5+Vehicle组,PM2.5+ZL0420组（n=10）。ZL0420为BRD4高效特异性抑制剂。所有小鼠饲养于独立通风笼（individually ventilatedcages,IVCs）中,给予灭菌饮用水和标准饲料。FA组:每日在固定器内固定4小时,每周5天,连续12周,吸入清洁空气。PM2.5组:将小鼠固定在PM 2.5多功能气溶胶浓缩富集系统的口鼻暴露器上,吸入浓缩的PM 2.5,每日4小时,每周5天,连续12周;PM2.5+Vehicle组:在固定于口鼻暴露系统之前1小时给予用于溶解药物的溶剂200μl腹腔注射,每天1次,每周5天,连续12周;PM2.5+ZL0420组在固定于口鼻暴露系统之前1小时给予ZL0420（10mg/kg）200μl腹腔注射,每天1次,每周5次,连续12周。2.检测指标及方法:PM2.5暴露12周后,用不同浓度的乙酰胆碱对小鼠气道进行激发,选取呼吸系统阻力（the respiratory system resistance,Rrs）,中央气道阻力（airway resistance,RN）,肺阻力（tissue damping,G）这三个指标评估小鼠肺功能;收集肺泡灌洗液,应用酶联免疫吸附实验测定IL-1β、IL-6、IL-8和BK的表达情况;左侧肺组织进行HE染色,在光学显微镜下观察各组肺组织的病理性改变;应用免疫组化评估肺组织中BRD4的表达情况;应用蛋白免疫印迹评估各组肺组织中BRD4、KLK14、B2R、MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达量。3.统计学分析:数据用均数±标准误（SEM）表示,采用SPSS 19.0版软件（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）进行分析。用两独立样本t检验分析两组之间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.C57小鼠在整个暴露周期中,日平均暴露浓度为820μg/m3,最高暴露浓度为2000μg/m3,最低暴露浓度为520μg/m3。2.在一定浓度乙酰胆碱激发的条件下,PM2.5组的Rrs,RN,和G值均高于对照组（P＜0.05）;PM2.5+ZL0420组Rrs,RN,和G均低于PM2.5+Vehicle组（P＜0.05）;此外,在12.5mg/ml乙酰胆碱激发条件下,PM2.5组（G,RN,Rrs）与基线值相比即可升高2倍,而能使对照组和PM2.5+ZL0420组（G,RN,Rrs）较基线值升高2倍的乙酰胆碱浓度明显高于12.5mg/ml。3.与对照组相比,PM2.5组和PM2.5+Vehicle组的肺组织病理结果显示,气道壁增厚,肺泡间隔增宽,肺泡结构遭到明显破坏,炎性细胞浸润,而PM2.5+ZL0420组气道壁增厚程度、肺泡结构破坏程度均较前者减轻,且浸润性炎性细胞数量有所减少。肺泡灌洗液中的细胞因子检测结果表明,与对照组相比,PM2.5组IL-1β（P=0.001）、IL-6（P=0.007）、IL-8（P=0.000）和BK（P=0.001）水平明显升高,与PM2.5+Vehicle组相比,PM2.5+ZL0420组肺泡灌洗液上述炎性细胞因子水平明显降低:IL-1β（P=0.007）,IL-6（P=0.005）,IL-8（P=0.000）,BK（P=0.04）。4.免疫组化结果表明,BRD4在肺组织中广泛表达,并且PM2.5暴露可促进肺组织中BRD4的表达。5.蛋白免疫印迹结果表明,与FA组相比,PM2.5可刺激肺组织中BRD4、KLK14、B2R、MMP2、MMP9和Vimentin的表达（P＜0.05）,而与PM2.5+Vehicle组相比,PM2.5+ZL0420组可明显抑制上述相关蛋白的表达（P＜0.05）。结论:BRD4参与了PM2.5引起的气道高反应,其机制与调控KLK14、B2R、MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达相关。第二部分PM2.5通过促进BRD4的表达增强气道平滑肌细胞的收缩功能目的:验证PM2.5是否通过调节BRD4的表达影响气道平滑肌细胞的收缩功能及具体机制。方法:1.分组:1)气道平滑肌收缩实验分组和检测指标:将PM2.5提纯成固态粉末溶于DMSO,通过0.22μm的滤网过滤获得母液,然后用细胞培养基稀释成不同浓度（μg/ml）（3.125,6.25,12.5,25）,作用于人气道平滑肌细胞24小时;2)采用脂质体转染法进行细胞转染将BRD4基因沉默,将实验分为4组,分别为NCsi RNA+DMSO组、BRD4si RNA+DMSO组、NCsi RNA+PM2.5组、BRD4si RNA+PM2.5组;3)选取BRD4特异性抑制剂（ZL0420）作用于细胞,将实验分为4组,分别为Control+DMSO,ZL0420+DMSO,Control+PM2.5和ZL0420+PM2.5;2.检测方法及指标:用细胞免疫荧光对气道平滑肌细胞中BRD4定位;用免疫印迹法评估BRD4、KLK14和B2R的蛋白表达情况;采用酶联免疫实验检测细胞上清液中BK的含量;采用细胞收缩试剂盒观察气道平滑肌细胞收缩情况,用细胞收缩环的大小评估细胞收缩程度。3.统计学分析:数据用均数±标准误（SEM）表示,采用SPSS 19.0版软件（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）进行分析。用两独立样本t检验分析两组之间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.气道平滑肌细胞在上述不同浓度的PM2.5干预作用下,BRD4表达量有所升高,其中在12.5μg/ml PM2.5的干预下BRD4相对蛋白表达水平最高;细胞免疫荧光结果表明BRD4定位在气道平滑肌细胞的细胞核中而非细胞质。2.与NCsi RNA+PM2.5组相比,BRD4si RNA+PM2.5组收缩功能降低,表现在气道平滑肌细胞的收缩环直径明显增加（P=0.003）;与Control+PM2.5组相比,ZL0420+PM2.5组收缩功能降低,表现在气道平滑肌细胞的收缩环直径明显增加（P=0.001）。3.BRD4基因沉默和抑制均可以抑制KLK14和B2R的表达量,进而减少细胞上清液中BK的水平（P＜0.05）。结论:BRD4参与了PM2.5诱发的气道平滑肌细胞的收缩过程,并且与BRD4可能调节KLK14、B2R蛋白的表达有关。第三部分PM2.5通过促进BRD4的表达增强气道平滑肌细胞的迁移功能目的:验证PM2.5是否通过调节BRD4的表达影响气道平滑肌细胞的迁移功能及具体机制。方法:1.分组:1)气道平滑肌收缩实验分组和检测指标:将PM2.5提纯成固态粉末溶于DMSO,通过0.22μm的滤网过滤获得母液,然后用细胞培养基稀释成不同浓度（μg/ml）（3.125,6.25,12.5,25）,作用于人气道平滑肌细胞24小时;2)采用脂质体转染法进行细胞转染将BRD4基因沉默,将实验分为4组,分别为NCsi RNA+DMSO组、BRD4si RNA+DMSO组、NCsi RNA+PM2.5组、BRD4si RNA+PM2.5组;3)选取BRD4特异性抑制剂（ZL0420）作用于细胞,将实验分为4组,分别为Control+DMSO,ZL0420+DMSO,Control+PM2.5和ZL0420+PM2.5。2.检测方法及指标:用免疫印迹法测定不同浓度PM2.5干预条件下,MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达量;同时用免疫印迹法测定BRD4基因沉默或被抑制后,参与迁移功能的MMP2、MMP9和Vimentin分子的表达量;采用Transwell实验评估气道平滑肌细胞的迁移功能。3.统计学分析:统计学分析:数据用均数±标准误（SEM）表示,采用SPSS 19.0版软件（SPSS Inc.,Chicago,IL,USA）进行分析。用两独立样本t检验分析两组之间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。结果:1.与对照组相比,气道平滑肌细胞在上述不同浓度的PM2.5干预作用下,气道平滑肌细胞迁移功能增强,并且在6.25μg/ml PM2.5悬液的干预作用下,细胞迁移功能最强（P=0.001）。此外与迁移功能相关的蛋白,MMP2、MMP9和Vimentin的表达量也有所增加。2.与NCsi RNA+PM2.5组相比,BRD4si RNA+PM2.5组气道平滑肌细胞迁移至下室的细胞数明显减少（P=0.002）;与Control+PM2.5组相比,ZL0420+PM2.5组迁移功能也降低,表现在气道平滑肌细胞迁移至下室的细胞数明显减少（P=0.000）;并且随着BRD4蛋白表达量的降低,MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达量也随之减少。结论:PM2.5在一定浓度的范围内通过上调BRD4的蛋白表达量进而促进气道平滑肌细胞的迁移,并且上述功能与BRD4可以调节MMP2、MMP9和Vimentin的蛋白表达有关。