背景大量研究表明，白细胞和血小板在动脉粥样硬化进程中起着重要作用，然而红细胞在动脉粥样硬化进程中的作用却很少报道。二十年余前，红细胞膜的胆固醇首先被发现与血清胆固醇相关，并可促进动脉粥样硬化的进程。此后又发现红细胞的吞噬可促进泡沫细胞的形成；红细胞血影细胞蓄积的膜脂质过氧化物，可使LDL易于被游离自由基介导的氧化作用氧化修饰。最近，又有研究表明内出血斑块内的红细胞进入斑块坏死核后成为游离胆固醇的主要来源之一，驱动动脉粥样硬化的进展，过多红细胞蓄积于斑块可能促使稳定性斑块转化成不稳定斑块，而且，那些内出血的斑块18个月内更易再次出血，反复出血刺激斑块，导致斑块不稳定性增加易于破裂。因此红细胞在动脉粥样硬化进程中扮演了重要角色。但是，红细胞在此过程中的作用机制尚未完全清楚，因此有必要进一步研究来了解红细胞诱导斑块不稳定的作用机制，以便找到适合途径来抑制或延缓红细胞诱导的这个进程。目的（1）建立相似于人类动脉粥样硬化斑块内出血的动物模型；（2）利用斑块内出血模型阐明斑块内出血与斑块稳定性之间的定性、定量关系；（3）明确斑块内出血后斑块不稳定性增高的机制。方法1．动物模型20只新西兰雄性大白兔来自山东农科院动物中心。斑块内出血兔模型是在已报道的模型基础上建立的。喂养含1％胆固醇2％猪油的高脂饲料一周后，20只新西兰大白兔全部接受球囊损伤后，继续喂养高脂饲料9周，此后喂养正常饮食。第18周，所有动物随机分为两组（50μL组，n=10；100μL组，n=10），常规麻醉下暴露腹主动脉，血管内超声（IVUS）（Galaxy，Boston Scientific Corporation，USA）检查斑块的形态和面积狭窄率后，在每只兔子腹主动脉上选择三个形态大小相似的腹主动脉斑块，50μL组中的每只兔子的三个斑块分别注射入50μL自身洗涤红细胞或50μL生理盐水或不进行注射，而100μL组中的每只兔子的三个斑块分别注射入100μL自身洗涤的红细胞或100μL的生理盐水或不进行注射。三种斑块的位置用髂腰肌缝线和距髂动脉分叉的距离共同定位。第24周，血管内超声再次检查后斑块的形态和面积狭窄率后分离腹主动脉。注射红细胞生理盐水或不进行注射的斑块（RBC斑块、NS斑块、空白斑块）被分别保存以备组织学和分子生物学检查。2．血清脂质在实验的开始、第10周（高脂饮食结束）、第18周（斑块内注射时间点），给动物抽血，置于肝素管中检测血清总胆固醇（TC），TC浓度用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶测定。3．IVUS检查在实验的第18周，血管内超声检查腹主动脉的形态和斑块面积狭窄率，每一腹主动脉选出三个形态大小相似的斑块被分别注射红细胞、生理盐水或不注射，注射过程中血管内超声监测保证斑块内注射的准确性。第24周，血管内超声再次检查腹主动脉斑块的形态和面积狭窄率的变化。每个血管内超声的操作都按标准程序进行。血管内超声使用血管内图像系统，机械探头于导管中（3.2F，40MHz）旋转产生横截面图像。图像帧频32f／sec，纵向横向分辨率分别为150μm和360μm，回撤速度0.5mm／sec。平均狭窄率是在每一腹主动脉十个等距点的横截面上的狭窄率平均值，按以下公式计算：狭窄率=外弹力膜面积-内膜腔面积／外弹力膜面积。4．组织学和免疫组化染色于4％福尔马林中固定腹主动脉。组织部分用石蜡包埋，切成5μm切片进行HE染色、Movat五色染色、Perls染色（检测铁）或免疫组化染色。部分组织做成6μm的冰冻切片用油红O染色来观察脂质含量。免疫组化染色用以往所述的标准程序进行。简单地说，就是内源性过氧化物酶活性用3％过氧化氢抑制后，5％（v／v）的山羊血清封闭，加入一抗4℃过夜。PBS洗涤后，加入二抗37℃30分钟。加入含0.02％（wt／vol）H2O2、过氧化物酶底物DAB（ZSBIO，Beijing，CHINA）的0.1％（wt／vol）PBS的显色剂，阳性反应区呈棕色，最后HE复染。，即用PBS取代一抗作为阴性对照。所用的一抗：抗兔巨噬细胞单克隆抗体（RAM11）（Lab VisionNeomakers，USA）稀释1：400来检测巨噬细胞；生物素化异凝集素B4（GSL-B4）（Vector，USA）稀释至10μg／mL检测红细胞膜。平均纤维帽厚度是在每个切片血管内膜的十个等距点测量的均值。脂质含量和纤维帽厚度的测定均用Image Pro Plus 5.1软件进行。以发现包埋的内膜或血栓覆盖于破裂斑块上作为斑块破裂标准。5．实时定量反转录多聚酶链反应（RT-PCR）用Trizol试剂抽提总RNA。用M-MLV反转录系统进行（Promega，Madison，USA）和oligo（dT）（16）引物进行总RNA的反转录，RNA纯度用分光光度计测定。采用实时定量RT-PCR检测MCP-1 mNA的表达水平。所用的引物和探针序列：GAPDH，Sense：GAA CGG GAA ACT CAC TGGCAT；Antisense：CCT TCT TGA TGT CGT CAT ACT TAGC；probeCTC CAG GCG GCA GGT CAG GTC CAC，GenBank accession：No．AB231852，退火温度（TA）：60℃，MCP-1，Sense：TCA TAG CAG TCGCCT TCA GC；Antisense：GTG TGT TCT TGG GTT GTG GAA TA；probeCTT GCC CAG CCA GAT GCC GTG AAT，GenBank accession：No．M57440，退火温度：58℃。6．数据统计学分析所有数据用mean±SD表示。两组血浆和红细胞脂质、MDA、SOD用单因素方差分析。斑块破裂率采用Chi-Square test分析。不同斑块采用随机区组设计的方差分析。组间比较采用非配对t-test，前后斑块狭窄率比较采用配对t-test。双尾p＜0.05被认为有显著性差异。数据用SPSS 13.0软件分析。结果实验结束时，一只100μL组兔子死于麻醉意外。1．血清脂质血浆胆固醇在实验开始时是1.25±0.21 mmol／L，10周高脂饮食后升到30.66±12.82mmol／L（P＜0.05 vs基线水平），6周正常饮食后降至1.24±0.81 mmol／L，基本与基线水平相似（P＞0.05）。2．IVUS检查实验第24周的斑块狭窄率低于18周的（32.11±8.09 vs 40.55±9.38）（P＜0.05）。但是RBC斑块、NS斑块和空白斑块间无显著差异（分别是30.51±7.09，34.14±9.49，33.25±6.06，所有P＞0.05）。3．组织学和免疫组化红细胞斑块中，100μL组中GSL-B4和Perls染色的阳性明显强于50μL组。NS斑块和空白斑块未检测到阳性。Movat五色染色见NS斑块和空白斑块中有较少泡沫细胞，少见胆固醇结晶。相反，红细胞斑块中提示大量泡沫细胞和胆固醇结晶和脂质成分堆积于内弹力膜上。红细胞斑块中，100μL组的脂质含量高于50μL组（0.75±0.08 vs0.60±0.08）（P＜0.05）。两组RBC斑块的脂质含量明显高于NS斑块和空白斑块，后两者间无显著区别（0.31±0.06，0.30±0.04）（P＞0.05）。红细胞斑块中，100μL组的巨噬细胞免疫染色明显强于50μL组。RBC斑块的巨噬细胞免疫染色也强于NS斑块和空白斑块，后两者的阳性染色强度相似。红细胞斑块中，100μL组的斑块纤维帽薄于50μL组（10.93±4.12 vs19.25±5.46）（P＜0.05）。RBC斑块的纤维帽也薄于NS斑块和空白斑块，后两者间无显著区别（45.33±9.72vs 51.00±10.74）（P＞0.05）。100μL组中的红细胞斑块破裂数多于50μL组（分别是66.7％，6／9和33.3％，3／10），但无显著性差异（P＞0.05）。两组的红细胞斑块破裂个数明显高于相应的生理盐水和空白对照两种斑块，破裂率有明显增高趋势，但统计学上无显著性差异（P＞0.05）。4．实时定量反转录多聚酶链反应（RT-PCR）红细胞斑块中，100μL组的MCP-1 mRNA表达高于50μL组（26.42±5.90vs20.43±7.71）（P＜0.05）。两组RBC斑块的MCP-1 mRNA表达明显高于NS斑块和空白斑块，后两者间无显著差异（1.32±0.73 vs 1.73±0.79）（P＞0.05）。结论（1）IVUS引导下利用斑块内注射技术经血管外膜在动脉粥样硬化斑块局部注射自身红细胞，成功建立易损斑块的动物模型；（2）斑块内出血后斑块不稳定性增高，且与出血量呈剂量依赖关系；（3）斑块内出血后斑块内的炎症细胞浸润、脂质含量增高、纤维帽变薄是红细胞致斑块不稳定性增高的可能机制；背景越来越多的证据表明红细胞可能是一种动脉粥样硬化的强力刺激物，可增加斑块不稳定的危险性。自1983年起红细胞膜的胆固醇含量就被发现可促进动脉粥样硬化进展。后来Kolodgie和Takaya进一步证实红细胞来源的脂质与斑块内出血的动脉粥样硬化斑块的坏死核相关联。另一方面，过氧化反应也在红细胞诱导的动脉粥样硬化进展中扮演了重要角色。Vila报道红细胞血影细胞可能积累膜脂质过氧化物，使LDL对自由基介导的氧化修饰敏感；血红蛋白来源的血红素被证实可作为LDL氧化修饰的一种催化剂；在H₂O₂和微粒体膜片段存在时，游离血红素还可导致不饱和脂质的剂量依赖性过氧化反应。血红素氧化酶—1（heme oxygenase-1，HO-1）作为血红素分解代谢的第一个限速酶，因其显著的抗氧化抗炎作用被广泛关注，它的抗动脉粥样硬化作用也已被多个实验证实。HO—1这些作用不仅由于血红素和其他氧化物的清除，还由于它的分解代谢产物—胆绿素、一氧化碳和胆红素具有强的抗氧化作用。在某些情况如斑块内出血时，血红素和其他源于红细胞的氧化物可促发斑块中的过氧化和炎症反应，同时也可诱导HO-1在斑块内表达。然而HO-1在斑块内出血等病变中的作用却未见报道，红细胞诱导的动脉粥样硬化斑块不稳定是否会因HO-1的过表达而改变也不清楚。本实验通过一斑块内出血的兔模型来观察斑块组织学、斑块内炎症因子的变化，探讨HO-1表达水平和这些变化的联系，试图阐明HO-1在红细胞诱导的动脉粥样硬化斑块不稳定中的作用。目的（1）进一步探讨斑块内出血后红细胞致斑块不稳定性增高的可能的分子生物学和病理机制；（2）探讨HO-1与斑块稳定性的关系；（3）探讨HO-1在内出血斑块中的作用及其机制。方法58只3-4个月新西兰雄性大白兔购自山东农科院动物中心。本研究遵照中国公布的实验动物管理使用条例。该动物模型是基于以往报道的模型建立的。喂养高脂饮食一周后（1％胆固醇及2％猪大油），58只新西兰大白兔接受了腹主动脉球囊拉伤，而后继续高脂饮食9周。此后喂养正常饮食直到第18周。在第18周，常规麻醉下暴露腹主动脉后，血管内超声（IVUS）检查每只兔子的腹主动脉斑块，并在每只兔子的腹主动脉上选择了三个形态大小相似的斑块，50μL洗涤的自身红细胞、生理盐水在血管内超声（IVUS）引导下分别经外膜注射入其中两个斑块，剩下的斑块作为空白对照。所有动物随机分为两组（hemin组，n=29；对照组，n=29）hemin组被腹腔内注入HO—1的诱导剂hemin（25mg／kg体重，4次／周），对照组注射生理盐水6周。在第24周，IVUS复检斑块大小后分离腹主动脉，注射红细胞的斑块（RBC plaques），注射NS的斑块（NS plaques）或未注射的斑块分别保存以备组织学染色和分子生物学检查。1．血清脂质、红细胞膜胆固醇和氧化抗氧化指标在实验的开始、第10周（高脂饮食结束）和第18周（红细胞注射时间点），动物兔禁食过夜后采血，胆固醇酯酶和氧化酶酶法测定总血浆胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、LDL、高密度胆固醇（HDL）。同样时间点同时检测了红细胞膜胆固醇和红细胞膜SOD、MDA。2．IVUS检查在第18周，在IVUS引导下每个腹主动脉选择三个相似的斑块来注射红细胞或生理盐水或不注射。在第18、24周，我们用IVUS在腹主动脉的10个等距点的横截面上测定了外弹力膜面积（EEMA）和内膜面积（LA）。斑块狭窄率PB％=（EEMA-LA）／EEMA每个血管内超声的操作都按标准程序进行。血管内超声检测采用血管内图像系统。血管内超声的机械探头于导管中（3.2F，40MHz）旋转产生横截面图像。图像帧频32f／sec，纵向横向分辨率分别为150μm和360μm，回撤速度0.5mm／sec。3．组织学和免疫组化染色腹主动脉片段用4％甲醛固定，部分腹主动脉片段用石蜡包埋，用5μm的石蜡切片来进行苏木素染色、Movat五色染色、Perls染色（观察铁沉积）以及免疫组化分析。6μm的冰冻切片用oil red O染色观察脂质含量。免疫组化操作据以往报道的标准程序进行，就是用3％过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性，5％山羊血清封闭，加入一抗后4℃孵育过夜。PBS洗涤后加入二抗37℃30分钟。加入0.02％（wt／vol）H₂O₂和0.1％（wt／vol）DAB显色剂（ZSBIO，CHINA）使阳性的区域呈现棕色。免疫组化用一抗是：抗兔巨噬细胞单克隆抗体（RAM11）（Lab Vision Neomakers，USA）稀释1：400来检测巨噬细胞；生物素化异凝集素B4（GSL-B4）（Vector，USA）稀释至10μg／mL检测红细胞膜；抗兔HO-1多克隆抗体：抗核转录因子κB抗体（NF-κB）p65；抗基质金属蛋白酶-9（MMP-9）抗体。在HO—1的测定中还应用了Vectastain ABC盒（VECTOR，USA），操作据标准程序进行[19]。阳性染色的多少以阳性面积在10个高倍镜（400X）下占斑块面积的平均百分率表示。阳性染色的百分率、纤维帽厚度和斑块的脂质含量用Image Pro Plus 5.1 software测量。平均纤维帽厚度用每个玻片上血管内膜的10个等距点上纤维帽厚度的平均值计算。以发现包埋的纤维帽或血栓覆盖于破裂内膜为斑块破裂标准。4．实时定量反转录多聚酶链反应（RT-PCR）用Trizol试剂提（Invitrogen）抽RBC斑块、NS斑块或空白斑块的RNA。用M-MLV反转录系统进行（Promega，Madison，USA）和oligo（dT）（16）引物进行总RNA的反转录，其质、量用分光光度计测定。从GenBank中获取mRNA序列。实时定量RT-PCR用LightCycler（Roche Applied Science，USA）并按照其说明书进行操作。SYBR Green I kit（TaKaRa Biotechnology，Dalian，China）用于HO-1 mRNA的检测，TaqMan探针用于MCP-1，VCAM-1，MMP-9和TIMP-1 mRNA的检测。定量值是根据循环数阈值（Ct）获得的，Ct值指首次荧光信号明显增高的那一点。glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）作为RNA内参。每个标本重复三次。数据用2_-△△CTmethod分析。结果用凝胶电泳进一步证实。所用的引物探针如表1所列。5．统计学分析资料用SPSS 11.5软件分析。所有的变量用mean±SD表达。血清、红细胞膜胆固醇、红细胞膜MDA和SOD用单因素方差分析。两组间的破裂率用卡方检验，同一组内不同斑块的数值比较用用随机区组设计的方差分析，组间差异用非配对t-检验。18周和24周的PB％差异用配对t-检验分析。P value＜0.05认为有显著性差异。数据用SPSS 13.0软件分析。结果1．血清脂质、红细胞膜胆固醇和红细胞MDA、SOD10周动脉粥样硬化饮食后血浆TC，TG，LDL和HDL水平明显提高（P＜0.05），8周正常饮食后下降至基线水平。然而，10周高胆固醇饮食后红细胞膜胆固醇仍保持于高水平尽管血浆脂质水平已随着饮食变化下降。红细胞膜的MDA和SOD的变化与红细胞膜胆固醇的变化一致（表1）。2．IVUS检查RBC斑块、NS斑块或空白斑块的PB％无显著差异（P＞0.05）（分别是40.21±9.15，39.11±8.07和41.21±12.32，所有P＞0.05）。但是，第24周时的总PB％低于18周时的总PB％（39.11±8.09 VS 42.55±9.38，P＜0.05）。第24周时，对照组的总PB％高于hemin组（45.75±11.23 VS 36.21±10.12，P＜0.05）。3．组织学和免疫组化HE染色显示红细胞斑块的纤维帽（12.93±6.12μm and 19.55±5.46μm）比NS（41.40±13.01μm and 42.77±11.34μm）或空白斑块的（41.26±11.71μm and44.12±6.07μm）薄（P＜0.05），NS和空白斑块间无显著差异（P＞0.05）。但是hemin和对照组间无显著差异（P＞0.05）。在对照组中，红细胞斑块的破裂率高于NS或空白斑块（53.6％vs．21.4％或25.0％，所有P＜0.05）。但在hemin组中，三种斑块的破裂率无显著差异（RBC斑块26.9％，NS斑块19.2％和空白斑块19.2％，所有P＞0.05）。hemin组中红细胞斑块的破裂率低于对照组（26.9％vs．53.6％，P＜0.05，），而NS和空白斑块的破裂率两组间无显著差异（对照和hemin组的NS斑块中分别为21.4％和19.2％；对照和hemin组的空白斑块中分别为25.0％和19.2％，所有P＞0.05）。NS和空白斑块中未见GSL-B4和Perls染色的阳性染色。两组的红细胞斑块这两种染色的阳性率也无显著差异（0.094±0.020 vs．0.099±0.016在GSL-B4染色中；0.075±0.011 vs．0.066±0.019在Perls染色中，所有P＞0.05）。Movat五色染色显示NS和空白斑块中少有胆固醇结晶，而红细胞斑块中可见大量的胆固醇结晶、脂质沉积和泡沫细胞。红细胞斑块的脂质含量（0.54±0.06和0.58±0.07，分别于hemin和对照组中）明显高于NS的（0.23±0.07和0.27±0.05，分别于hemin和对照组中）或空白斑块的（0.29±0.04和0.22±0.05，分别于hemin和对照组中）（所有P＜0.05），而两组中的NS或空白斑块的脂质含量无显著差异（所有P＞0.05）。这三种斑块的脂质含量在两组间均无显著差异（P＞0.05）。免疫组化中，两组中的红细胞斑块的巨噬细胞阳性染色均强于NS或空白斑块（P＜0.05）。它在对照组中也强于hemin组（P＜0.05）。抗-NF-κB，抗-MMP-9的免疫染色结果与抗巨噬细胞的免疫染色相似，除了抗-MMP-9的免疫染色在hemin和对照组间无显著差异。红细胞斑块中的HO-1阳性染色强于NS或空白斑块的（P＜0.05），在hemin组中它也强于对照组。4．实时定量反转录多聚酶链反应（RT-PCR）HO－1 mRNA在红细胞斑块中的表达明显高于NS或空白斑块，在hemin组中的表达也高于对照组（所有P＜0.05）。两组的红细胞斑块的MCP-1，MMP-9和VCAM-1相对mRNA表达均高于NS或空白斑块的（所有P＜0.05）。hemin组中的MCP-1和VCAM-1相对mRNA表达低于对照组（所有P＜0.05）。相反，两组的红细胞斑块的TIMP-1 mRNA相对表达均低于NS或空白斑块的（所有P＜0.05）。结论（1）斑块内出血后斑块内脂质含量增高、氧化应激水平增高、炎症细胞浸润、纤维帽变薄可能是红细胞致斑块不稳定性增高的原因；（2）HO-1可减少内出血斑块的破裂率，对内出血斑块有保护作用；（3）HO-1的作用可能是通过抑制斑块内氧化应激水平、降低斑块内炎症因子的表达，抑制斑块内的炎症实现的。