氧化亚铜纳米酶的制备及其多酶活性的研究

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天然酶是具有高度选择性的生物催化剂,能够参与生命系统中的各种代谢过程。天然酶具有催化效率高、底物专一性强等优点,因此被应用于医药、化工、生物技术等领域。但因为其稳定性低、成本高、分离提纯以及回收困难、不易保存、对环境敏感,在酸性、碱性以及高温条件下易变性失活等固有缺点,从而导致天然酶的广泛应用受到了很大程度的限制。为了改变天然酶的局限性,研究人员长期致力于天然酶的替代物的探究。纳米酶被定义为具有酶活性的纳米材料,既有纳米材料所固有的优良特性,同时又有催化功能。作为一种新型的人工酶,纳米酶具有可调节的催化活性、制备简单、成本低、在酸、碱和高温条件下稳定性高、易于大规模生产等优点。与天然酶以及传统的人工酶相比,纳米酶具有非常明显的优势。氧化亚铜纳米酶(Cu2O Nanozyme,CNE)是一类具有良好生物相容性的新型纳米酶,具有成本低、稳定性高、储量丰富等优点,因此被广泛地应用于抗肿瘤、抗菌、光催化、生物传感等各个领域。但已有的氧化亚铜纳米酶的制备方法普遍具有操作复杂、成本高、不易控制产物的尺寸和形貌、对设备要求高等问题,而本论文利用简单的溶液方法进行制备,不仅易于操作、成本低,还能够控制氧化亚铜纳米酶的尺寸和形貌,极大的改善了已有制备方法的弊端。维生素C(Vc,抗坏血酸)是人类体内必需的一种水溶性维生素,缺乏维生素C能导致关节肿胀甚至癌症等疾病。但过量的维生素C易出现泌尿系统结石、腹泻等问题。所以快速、准确地检测食物、药物中维生素C的含量很有必要。已有的检测方法普遍具有灵敏度低、操作复杂、干扰因素多等问题,而利用氧化亚铜纳米酶检测维生素C含量,不仅改善了这些问题,还为食品、医疗、工业生产中的维生素C检测提供了新思路。本论文致力于研究简单经济、具有高效纳米酶活性的氧化亚铜纳米酶的合成方法以及建立具有应用前景的维生素C检测方法,具体研究内容如下:(1)氧化亚铜纳米酶的合成制备:通过一种简单的溶液方法制备高度均匀的立方体CNE。利用聚乙二醇600和抗坏血酸,使CuSO4·5H2O还原的方法进行制备。此方法可以通过改变聚乙二醇的浓度以及试剂的添加顺序,从而合成不同尺寸的立方体CNE。通过紫外-可见吸收光谱和透射电镜等方式进行表征,证明成功的合成了100 nm,150 nm,250 nm的立方体CNE,且该纳米材料尺寸均一,分散性良好。(2)氧化亚铜纳米酶的酶学性质探究:研究发现CNE具有良好的类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性以及类抗坏血酸氧化酶活性。首先,CNE在H2O2存在时能催化底物TMB显色,在652 nm处有吸收峰,并且在p H=4,温度为75℃时,CNE的类过氧化物酶活性最高,通过对其稳态动力学进行测定,表明了CNE的类过氧化物酶的催化机制是乒乓机制;其次,CNE可以催化H2O2分解为氧气和水,表现出类过氧化氢酶活性,此催化反应的最适p H为10。在一定范围内,CNE的类过氧化氢酶活性能够随着温度的升高而增强,并且动力学的结果表明,其符合米氏酶模型;最后,CNE能够催化抗坏血酸生成脱氢抗坏血酸,在265 nm处能够产生吸收峰,此催化反应的最适p H为6。在一定范围内,CNE的类抗坏血酸氧化酶活性随着温度的升高而增强,并且根据动力学的结果可知,其反应初速度和底物浓度之间存在依赖关系,其动力学机制遵循米氏酶模型。(3)通过CNE对不同底物的催化特异性进行分析,CNE可以用于饮料中维生素C的检测,常见的干扰物质不会影响CNE对Vc含量的检测。利用CNE体系检测多种饮料等产品中Vc含量的结果与通过碘量法的测定结果一致,表明CNE能够应用于实际产品中Vc含量的测定。综上所述,本文成功的合成了具有良好的类过氧化物酶活性、类过氧化氢酶活性以及类抗坏血酸氧化酶活性的氧化亚铜纳米酶,并且CNE能够在温和条件下催化抗坏血酸形成氧化型的脱氢抗坏血酸(DHAA),DHAA与邻苯二胺(OPDA)反应生成荧光产物,可以用于维生素C的检测。此检测方法成本低、效益高、制备简单、具有高度的选择性和灵敏度,同时具有线性范围宽、检测限低、反应稳定、误差较小等优势,可以应用于实际产品中维生素C含量的测定。
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