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乙型肝炎是乙型肝炎病毒(HBV)引起的传染性疾病,可导致肝硬化和肝癌,危害性极大。西医主要治疗药物为干扰素及核苷类药物,有比较好的疗效,但易产生耐药性且副作用大,不适于长期用药。中药具有来源广泛,毒、副作用小,价格低廉等特点,在抑制乙肝病毒方面具有一定的开发前景。为了更准确、更方便的寻找低毒高效的抑制HBV药物,本课题运用体外抑制HBV药物筛选体系HepG2215细胞系,进行中药抑制HBV的体外研究。本课题的研究内容如下:
1.药物对细胞的毒性实验:本实验通过显微镜观察细胞形态学病变(CPE)法进行细胞毒性实验。病变程度分五级:实验孔的细胞与空白对照孔细胞相比形态和数量完全圆化变形为4,病变75％为3,病变50％为2,病变25％为1,均无区别者为0。
2.106种单味中药乙醇提取液的制备:中药亲水性的成分除蛋白质、粘液质、果胶、淀粉和部分多糖等外大多能在乙醇中溶解,且难溶于水的亲脂性成分在乙醇中的溶解度也较大。乙醇提取法能同时去除中药中的果胶等杂质,使提取液清澈透亮,不易霉坏变质。同时购买了39种中药单体。
3.HepG2215细胞模型的建立:HepG2215细胞株是1986年美国The Mount Sinai Medical Center建立的,其能稳定地分泌乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒e抗原(HBeAg)和HBV颗粒。近10年来已成功地应用于抑制HBV药物的筛选,是研究药物抑制HBV的理想模型,并作为抑制HBV作用的指标,被中国卫生部收载于治疗肝炎的中药新药药效学研究指南。该方法操作简便、条件可控、重复性好。
4.药物对HepG2215细胞HBsAg、HBeAg的抑制作用:运用HepG2215细胞系对106种单味中药乙醇提取液及39种中药单体进行抑制乙肝病毒的体外研究。实验结果表明:106种单味中药乙醇提取液中有34种对HBsAg有明显抑制作用,其中金荞麦最高抑制率可达88.36％:有10种对HBeAg有明显抑制作用,其中秦艽最高抑制率可达76.1％。有8种对两种抗原均有明显抑制作用,如石榴皮对HBsAg最高抑制率为82.07％,对HBeAg最高抑制率为73.61％。39种中药单体中有4种对HBsAg抑制作用明显,这4种中药单体是芦荟大黄素、绿原酸、槲皮素、双氢青蒿素,抑制率均大于50％。但39种中药单体对HBeAg均无明显抑制作用。
5.药物对HepG2215细胞DNA复制的抑制作用:采用PCR(聚合酶链反应法)结合荧光探针的体外扩增和检测技术,测定筛选出的4种有效中药单体作用后的HepG2215细胞HBV-DNA含量。实验结果表明:这4种中药单体虽然对HBV-DNA复制无明显抑制作用,但可见抑制趋势。