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第一章:焦磷酸测序法测定肾移植受体人群中CYP3A5*3基因多态性的分布目的:建立焦磷酸测序法(PyrosequencingTM) CYP3A5*3基因多态性的检测方法,并研究CYP3A5*3基因多态性在肾移植受体人群中的分布,为临床实践中快速、准确、可靠地检测肾移植受体CYP3A5*3提供一种新的技术。方法:选取245例肾移植受体为研究对象,术前或者术后采取血标本并提取外周血基因组DNA,同时提取200例健康人外周血DNA作为正常对照组,应用带有生物素标记的扩增引物,经PCR扩增及磁珠分离,制备CYP3A5*3突变位点焦磷酸测序单链模板,并在PyroMark ID焦磷酸测序仪上进行焦磷酸测序,采用Beckman coulterCEQ800遗传分析仪进行DNA测序作为标准对照,观察分析焦磷酸测序法的可靠性并分析肾移植受体人群CYP3A5*3基因多态性的分布。结果:建立了基于焦磷酸测序技术的CYP3A5*3多态性检测新方法,实现了DNA标本的快速、可靠、高通量检测,经重复性检测和Sanger标准法DNA测序可靠性检测,用焦磷酸测序技术检测CYP3A5*3多态性的突变检查率及重复率均达100%。245例肾移植受体CYP3A5*3基因型分布:*1/*1型为23例(9.4%),*1/*3型为101例(41.2%),*3/*3型为121例(49.4%),CYP3A5*3基因突变频率为70.0%;200例健康对照人群CYP3A5*3基因型分布:*1/*1型为15例(7.5%),*1/*3型为89例(44.5%),*3/*3型为96例(48.0%),CYP3A5*3基因突变频率为70.3%;肾移植受体人群与正常人群比较,等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡。结论:与传统的测序方法相比,焦磷酸测序法能够简单、快速、准确的测定肾移植受体CYP3A5*3基因型,适合在临床上推广应用。在我国肾移植受体人群中CYP3A5表达型(*1/*1型和*1/*3型)与不表达型(*3/*3型)比例相当,术前有必要测定肾移植受体CYP3A5*3基因多态性,以助于免疫抑制剂的个体化治疗。第二章:CYP3A5*3基因多态性对肾移植受体他克莫司药物浓度和疗效的影响目的:采用焦磷酸测序法(PyrosequencingTM)测定肾移植受体CYP3A5*3基因多态性,观察肾移植受体CYP3A5*3基因多态性对术后他克莫司(tacrolimus, Tac, FK506)药物浓度和疗效的影响,探讨服用FK506的肾移植受体CYP3A5*3基因多态性的意义,为CYP3A5*3基因多态性指导肾移植术后FK506个体化用药研究提供依据。方法:选取以FK506为基础免疫抑制剂治疗的86例亲属活体肾移植患者,用焦磷酸测序法(PyrosequencingTM)测定CYP3A5*3基因型,用均相酶扩大免疫分析法(enzyme multiplied immunoassay technique, EMIT)测定患者FK506全血药物谷浓度,并收集患者肾移植术后第7、14天、1月、3月和6月时的FK506药物谷浓度/校正剂量比值以及6月内患者急性排斥反应、药物毒副作用等不良事件的发生情况。结果:86例肾移植受体CYP3A5*3基因型分布:*1/*1型为12例(13.9%),*1/*3型为30例(34.9%),*3/*3型为44例(51.2%)。CYP3A5*1/*1型受体和*1/*3型受体肾移植术后相同时点FK506药物浓度/校正剂量显著低于CYP3A5*3/*3型受体。CYP3A5*1/*1型和CYP3A5*1/*3型患者6月内急性排斥反应显著高于CYP3A5*3/*3型受体,神经毒性、高血糖发生率CYP3A5*3/*3型受体较高,但无统计学差异,药物肾毒性和其他毒副反应发生率比较也无显著差异。结论:CYP3A5*3基因型与肾移植术后FK506药物代谢具有显著影响。CYP3A5*1型携带者需要比CYP3A5*3/*3更高的FK506剂量才能达到有效目标血药浓度。移植术前采用焦磷酸法测定肾移植受体CYP3A5*3多态性,有助于确定不同CYP3A5*3基因型个体移植术后FK506的理想起始剂量,迅速达到有效的免疫抑制,从而提高肾移植的疗效。第三章:CYP3A5*3基因多态性指导肾移植受体他克莫司个体化药物治疗的临床应用研究目的:研究CYP3A5*3基因多态性指导肾移植受体他克莫司(FK506)个体化用药的临床应用价值,初步探讨中国人群中不同CYP3A5*3基因型肾移植受体FK506的理想初始剂量。方法:在术前1-2周内采用焦磷酸测序法(PyrosequencingTM)测定肾移植受体CYP3A5基因型(CYP3A5表达型CYP3A5*1/*1、CYP3A5*1/*3和不表达型CYP3A5*3/*3)。随机将83例病人分为实验组和对照组,实验组根据CYP3A5基因型的不同调整肾移植术后FK506的初始剂量(表达型为0.15mg/(kg·d),不表达型为0.075mg/(kg·d)),对照组按照传统的给药剂量(0.10mg/(kg·d))。两组受体肾移植术后采用FK506+MMF+Pred免疫抑制方案,术后跟踪随访3个月以上,比较两组肾移植术后7天内达到目标血药浓度范围((6~10) ng/mL)的百分比、需调整药物剂量的百分比以及3月内急性排斥反应和药物毒副作用(神经毒性、高血脂、高血糖等)发生率之间的差异。结果:肾移植术后7天内实验组达到目标血药浓度浓度范围百分比显著高于对照组(62.5%比32.6%,P<0.05),而实验组需要调整剂量的百分比显著低于对照组(35%比65.1%,P<0.05)。实验组和对照组肾移植术后3个月内急性排斥反应发生率分别为20.0%和25.6%,发生毒副反应的比例分别为12.5%和18.6%,实验组较对照组低,但两者比较尚无明显统计学差异(P>0.05)。结论:根据CYP3A5*3基因型调整FK506初始用量,能够使各基因型患者在肾移植术后早期迅速达到目标血药浓度范围,减少肾移植早期调整药物剂量的比例,降低药物暴露不足导致的急性排斥反应或者暴露过量所导致毒副作用的发生率。