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接种疫苗并检测CSFV免疫抗体水平是预防与控制猪瘟的重要技术手段。本研究通过原核表达系统高效表达了可溶性的CSFV E2蛋白,用亲和层析方法纯化,获得重组E2蛋白抗原。进行了猪瘟的检测及免疫方面的应用研究:建立了一种检测CSFV抗体的间接ELISA方法,研制了相应的诊断试剂盒;将纯化的重组E2蛋白制作为亚单位分子疫苗,通过免疫本动物猪,研究了免疫效果。以上研究为最终成功研制安全、高效、可鉴别的猪瘟亚单位疫苗奠定了基础。 1.在大肠杆菌中表达可溶性的CSFV E2蛋白。 应用RT-PCR和nPCR扩增了中国CSF兔化弱毒(C-株)的E2基因,构建了原核表达载体pGEX4T-1,转入到宿主菌BL21(Star)中,在较低的温度(16℃)和硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)浓度(0.1mmol/L)下对重组菌进行了诱导表达,高效表达了可溶性的重组E2蛋白。结果显示,E2蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达,可溶性蛋白的表达量占融合蛋白的40%。 2.用亲和层析法纯化重组E2蛋白。 GST融合蛋白与谷胱甘肽的结合是可逆的,用加入还原性谷胱甘肽的洗脱液可以高效地把结合态GST融合蛋白洗脱下来。本实验使用MagneGST吸附型树脂颗粒,通过亲和层析方法快速、简易、高效地从表达菌中分离纯化出重组E2蛋白,亲和层析纯化后其纯度可达到约85%,其浓度可达5mg/mL,为研究猪瘟诊断试剂盒和新型亚单位分子疫苗奠定了坚实的物质基础。 3.建立并优化了一种检测CSFV抗体的间接ELISA方法,并研制出相应的猪瘟间接ELISA诊断试剂盒。用纯化的重组E2蛋白作为抗原包被酶标板,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗,建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法,并确定了ELISA最佳工作条件:抗原包被浓度分别为8.91μg/mL;包被条件为37℃放置1h后,再4℃过夜;猪瘟阳性血清(1:80)在37℃作用45min,酶标二抗(1:1000)在37℃作用45min;底物溶液37℃显色15min。通过敏感性实验、特异性试验、重复性试验、对比实验和稳定性试验,表明:该方法的特异性为98.6%,敏感性为95.3%;与国外IDEXX公司的同类试剂盒比较,两者的符合率为92%。用已建立的方法检测送检血清样本500份,阳性率为86.4%。 4.用重组E2蛋白进行本动物免疫实验。 利用大肠杆菌表达的可溶性重组E2蛋白作为抗原,用弗式佐剂乳化后经皮下途径接种40日龄仔猪(猪瘟病毒抗原抗体皆为阴性)7头。每次免疫后21天后采血,利用夹心ELISA和正向间接血凝检测抗体的变化,第二次免疫后21天时进行攻毒保护试验。结果表明,第二次加强免疫后抗体水平明显上升;攻毒后对照组4头猪中有三头在3～8天之间全部死亡,第四头猪在14天时处于频死状态,疫苗免疫猪全部存活,无猪瘟病毒感染后的临床症状;无菌采免疫组猪的扁桃体和脾脏,利用RT-PCR方法扩增E2基因,结果为阴性,利用IDEXX公司CSFV抗原检测试剂盒检测猪瘟病毒抗原为阴性。本动物试验结果证明利用大肠杆菌表达的重组E2蛋白能够诱导猪产生中和抗体,并且有确实的免疫效果。