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目的:基于“脾肾相关”理论从miRNAs调控Wnt信号通路促进成骨角度探究补肾健脾方及其拆方防治尾吊大鼠骨丢失的作用机制。材料与方法:Wistar大鼠80只,雄性,6周龄,体重200±20g,随机分为五组:正常组,模型组,补肾组,健脾组,补肾健脾组,每组16只,单笼饲养。根据人和动物体表面积折算的等效剂量比值给大鼠灌胃给药,健脾方生药量为2.43g/kg,补肾方生药量为3.24g/kg,补肾健脾方生药量为5.67g/kg,补肾组、健脾组和补肾健脾组大鼠各每日灌胃给药相同体积药液（均为2ml）,正常组和模型组给与2ml蒸馏水。除空白对照组外其他各组均采用尾吊法造模,于造模当日灌胃给药,每日1次,给药21天,于第22天每组大鼠取10只给与水合氯醛腹腔注射麻醉,取腹主静脉血,室温静置后离心,取上层血清,置于EP管中标记,放入-20℃冰箱保存备用。各组其余大鼠颈椎脱臼法处死,在超净工作台分离股骨软组织、筋膜,冲洗髓腔,将冲洗的液体制成单细胞悬液,吹打,离心,弃去上层脂肪层,培养液重悬制成单细胞悬液,传代培养直至P3代,进行成骨诱导。分别采用El isa法检测各组血清骨钙素（OC）含量;对硝基苯磷酸盐法（PNPP）检测各组B MSCs的ALP活性;茜素红染色检测各组BMSCs的钙结节形成情况。取32只体重200±20g（6周龄）雄性Wistar大鼠32只,随机四组,分别为空白组,健脾组,补肾组和补肾健脾组,将大鼠适应性喂养1周后,将各组大鼠分别灌胃对应药物:健脾方生药量为2.43g/kg,补肾方生药量为3.24g/kg,补肾健脾方生药量为5.67g/kg,补肾组、健脾组和补肾健脾组大鼠各组每日灌胃给药2ml药液,空白组灌胃给与2ml蒸馏水,灌胃5天,末次灌胃给药1h后,用水合氯醛腹腔注射麻醉,取腹主静脉血,室温静置后离心,取上层血清,同组混合在一起,56℃水浴灭活,用滤膜过滤,分装,置于-80℃超低温冰箱备用,将购买的Ori Cell Wistar大鼠骨髓间充质干细胞P2代传至P3代,分为5组,分别用正常组含药血清,成骨诱导液,健脾组含药血清加成骨诱导液,补肾组含药血清加成骨诱导液,补肾健脾组含药血清加成骨诱导液培养骨髓间充质干细胞,蛋白质免疫印迹技术（Western-blot）检测β-catenin、GSK3β、GSK3β磷酸化的蛋白表达;实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-214-3p、miR-10a-5p、Wnt3a和成骨相关基因Runx2的mRNA表达。结果:1.补肾健脾方及其拆方对尾吊大鼠成骨分化能力的影响1.1补肾健脾方及其拆方对尾吊大鼠血清OC的影响与正常组相比较,模型组大鼠血清OC含量明显下降（P＜0.01）;与模型组相比,健脾组、补肾组和补肾健脾组大鼠血清OC含量明显增加（P＜0.01）;与健脾组相比,补肾健脾组大鼠血清OC含量明显增加（P＜0.01）。1.2.补肾健脾方及其拆方对尾吊大鼠体内BMSCs的ALP活性的影响 与正常组相比较,模型组大鼠BMSCs ALP活性明显下降（P＜0.01）;与模型组相比,健脾组、补肾组和补肾健脾组大鼠BMSCs ALP活性明显增加（P＜0.01）;与健脾组相比,补肾组、补肾健脾组大鼠BMSCs ALP活性明显增加（P＜0.01）;与补肾组相比,补肾健脾组大鼠BMSCs ALP活性无明显变化（P＞0.05）。1.3补肾健脾方及其拆方对尾吊大鼠BMSCs成骨分化诱导后钙结节形成的影响 与正常组相比,模型组染色面积明显减小;与模型组相比,健脾组、补肾组和补肾健脾组的染色面积均明显增大;与健脾组和补肾组相比,补肾健脾组染色面积明显增大。2.补肾健脾方及其拆方含药血清经miRNAs调控Wnt信号通路促成骨的机制研究2.1补肾健脾方及其拆方含药血清经miRNAs调控Wnt信号通路促成骨中β-catenin、GSK3β、p-GSK3β蛋白表达的影响 与正常组比较,成骨诱导组β-catenin蛋白表达量显著增高（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,健脾组、补肾组和补肾健脾组β-catenin蛋白表达量均显著增高（P＜0.01）;与健脾组比较,补肾组和补肾健脾组β-catenin蛋白表达量均显著增高（P＜0.01）;与补肾组比较,补肾健脾组β-catenin蛋白表达量明显增高（P＜0.01）。与正常组比较,成骨诱导组GSK3β蛋白表达量显著增高（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,健脾组GSK3β蛋白表达量显著增高（P＜0.01）,补肾健脾组GSK3β蛋白表达量显著降低（P＜0.01）;与健脾组比较,补肾组和补肾健脾组GSK3β蛋白表达量均显著降低（P＜0.01）;与补肾组比较,补肾健脾组GSK3β蛋白表达量明显降低（P＜0.01）。与正常组比较,成骨诱导组p-GSK3β蛋白表达量显著增高（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,健脾组、补肾组和补肾健脾组p-GSK3β蛋白表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾组比较,健脾组和补肾组p-GSK3β蛋白表达量显著降低（P＜0.01）。2.2补肾健脾方及其拆方含药血清经miRNAs调控Wnt信号通路促成骨中miR-214-3p、miR-10a-5p、Wnt3a和成骨相关基因Runx2 mRNA表达的影响 与正常组比较,成骨诱导组miR-214-3p表达量显著降低（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,补肾健脾组miR-214-3p表达量明显降低（P＜0.01）。与正常组比较,成骨诱导组miR-10a-5p表达量显著降低（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,补肾健脾组miR-10a-5p表达量明显降低（P＜0.01）。与正常组比较,成骨诱导组Wnt3a表达量显著增高（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,健脾组、补肾组和补肾健脾组Wnt3a表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾组比较,健脾组和补肾组Wnt3a表达量显著降低（P＜0.01）。与正常组比较,成骨诱导组Runx2表达量显著增高（P＜0.01）;与成骨诱导组比较,健脾组、补肾组和补肾健脾组Runx2表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾组比较,健脾组和补肾组Runx2表达量显著降低（P＜0.01）。结论:1.补肾健脾方及其拆方均可以升高尾悬吊大鼠血清OC水平,升高BMSCs成骨诱导14天后ALP水平以及促进钙结节形成,推测补肾健脾方及其拆方具有促进尾悬吊大鼠成骨分化的作用,进而改善尾吊大鼠的骨丢失,且补肾健脾方组的作用最为显著,补肾方作用强于健脾方。2.补肾健脾方可以降低miR-214-3p和miR-10a-5p的表达,升高Wnt3a、β-catenin、p-GSK3β和Runx2的表达,降低GSK3β的表达,推测补肾健脾方可以通过抑制miRNAs的表达进而抑制GSK3β磷酸化β-catenin,促进β-catenin的积累,促进Wnt信号通路表达,促进BMSCs成骨分化。补肾方与健脾方不可以降低miR-214-3p和miR-10a-5p的表达,但可以升高Wnt3a、β-catenin、p-GSK3β和Runx2的表达,降低GSK3β的表达,推测补肾方和健脾方也可以通过Wnt信号通路促进BMSCs成骨分化,但与miRNAs无关。