轮状病毒(Rotavirus,RV)是导致婴幼儿腹泻最主要的病原体之一,属于呼肠病毒科,是一种无包膜的二十面体形状病毒。在病毒与宿主细胞这场博弈的过程中,病毒已经进化形成了一系列通过利用宿主细胞自身的代谢机制从而来抵御宿主免疫系统防御的策略,在这其中就包括编码microRNA分子。前期研究中,我们筛选了RV感染宿主细胞MA104后差异表达的miRNAs。发现其中小RNA分子chr-1755在感染RV后出现明显上调,推断该分子可能在轮状病毒复制中发挥重要作用。经过生物学性质研究后,我们将其命名为vsRNA1755。通过软件对vsRNA1755的可能靶基因进行预测,发现轮状病毒VP3可能是vsRNA1755的潜在靶点。目的:本研究旨在明确VP3是否为vsRNA1755的靶点,分析vsRNA1755通过调控自身基因影响轮状病毒复制的具体调控机制。方法:miRnada软件预测结果显示vsRNA1755可以靶定轮状病毒VP3基因,随后通过双荧光素酶实验验证vsRNA1755和VP3之间的靶定关系。体外构建携带VP3的真核表达载体,与vsRNA1755 mimics共转染MA104细胞,通过Western Blot和RT-PCR检测VP3的表达,明确vsRNA1755与VP3之间的靶定关系。进一步,体外合成针对vsRNA1755分子的mimics(模拟物)和inhibitor(抑制剂)转染MA104细胞,通过免疫荧光、CPE时间、NSP3拷贝数检测轮状病毒复制情况,通过蚀斑法、qRT-PCR检测子代病毒滴度,评价vsRNA1755对病毒复制的作用。合成针对vsRNA1755分子的agomir(体内模拟物)和antagomir(体内抑制剂),以灌胃方式转入Balb/c小鼠体内,上调和下调vsRNA1755表达水平。灌胃24h后用轮状病毒SA11株感染小鼠。每隔12h观察症状并进行腹泻评分。按压腹部收集小鼠粪便,通过胶体金和ELISA进行抗原检测,评价病毒排毒情况。与12h、24h、48h、72h每组处死两只小鼠,收集小鼠的小肠组织,做石蜡切片、HE染色、提RNA做病毒拷贝数检测、透射电镜观察小肠绒毛病理改变。结果:轮状病毒感染前后细胞差异表达的miRNA测序分析,确认vsRNA1755为研究对象,数据库预测及双荧光素报告实验发现vsRNA1755可特异性靶定轮状病毒VP3基因,蛋白检测及荧光观察验证vsRNA1755可调控RV感染细胞内及pEGFP-N2-VP3载体的VP3表达水平。免疫荧光结果显示,vsRNA1 755上调(Mimics)可抑制RV复制,CPE时间观察试验和NSP3 RT-qPCR病毒核酸PAGE电泳检测结果显示,上调vsRNA1755能够抑制RV的复制效率,下调vsRNA1755可以促进RV的病变速度。同时,蚀斑检测结果显示,vsRNA1755也可抑制RV子代病毒的滴度。体内实验发现,vsRNA1 755过表达后乳鼠腹泻情况减轻,粪便中RV抗原含量降低,小肠中RV拷贝数降低。组织病理学观察发现,vsRNA1755过表达后小肠组织病理改变减轻,尤以回肠最为显著。反之,抑制vsRNA1755表达后,乳鼠腹泻时间延长,腹泻情况加重,粪便中排毒量增加,小肠中病毒拷贝数增加,小肠病理改变加重,特别是回肠病变加重明显。结论:体外研究表明,vsRNA1755可通过靶定轮状病毒的VP3基因,抑制病毒VP3蛋白的表达,进一步抑制轮状病毒复制效率,从而调控病毒增值速度。体内实验发现,乳鼠通过灌胃过表达vsRNA1755后再攻毒,可抑制轮状病毒在小肠中的复制。轮状病毒感染宿主后vsRNA1755表达水平上调是病毒做出的主动调控策略,且该调控策略是限制病毒增殖速率,目的是以防宿主细胞迅速死亡无法支持病毒继续增殖。