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背景： 冠状病毒(Coronavirus，CoV)是冠状病毒科、冠状病毒属的有包膜的单股正链RNA病毒。冠状病毒的感染宿主范围广泛，在多种动物和人类都有流行。目前已知能感染人的冠状病毒有6种，人冠状病毒HCoV-229E、-NL63、-HKU1、-OC43、严重急性呼吸道综合症冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle east respiratory syndromecoronavirus，MERS-CoV)。由于较高的基因组重组和突变率，导致冠状病毒在过去的几十年内不断出现新的基因型、血清型，甚至新的毒株，也出现了宿主范围的改变而跨种属传播的情况。目前已知能感染犬类的冠状病毒有两种，犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)和犬呼吸道冠状病毒(Canine respiratorycoronavirus，CRCoV)，在犬科动物中导致轻重不一的胃肠道或呼吸道症状。从犬冠状病毒的检出开始，已经发现在全球范围内广泛流行，且不同年龄、不同种的犬群都能感染。但是，近年在中国关于犬冠状病毒流行情况和病毒分子学的研究报道较少，数据都比较陈旧，而全面系统的基因特点分析更少。此外，目前关于犬冠状病毒与人冠状病毒之间的交叉反应的研究也较少，且由于核衣壳蛋白具有较高的氨基酸同源性，不同冠状病毒之间常出现血清学交叉反应，给冠状病毒的血清学检测带来困难。 研究目的： 对北京地区宠物犬冠状病毒(CCoV, CRCoV)及其他常见RNA病毒(CPIV,CDV)进行分子流行病学调查，为犬病防治提供指导;对CCoV, CRCoV冠状病毒基因组序列特点及CCoV, CRCoV核衣壳蛋白与人冠状病毒之间的交叉反应分析，旨在了解犬冠状病毒的基因多样性及抗原反应性，为冠状病毒血清学诊断方法提供参考，同时有助于冠状病毒跨种属传播分子机制的研究。 研究方法及结果 一、宠物病犬冠状病毒的筛查检测 为了对北京地区宠物犬四种常见RNA病毒的流行情况及基因特点进行研究，从中国农业大学动物医院采集246份宠物病犬拭子样本，针对保守的N基因通过PCR并测序鉴定的方法对犬冠状病毒(CCoV)、犬瘟热病毒(CDV)、犬呼吸道冠状病毒(CRCoV)和犬副流感病毒(CPIV)进行筛查检测。在所有246份样本中，CCoV阳性率最高，有64份样本检出(26.0％，64/246，95％CI:19.3％-31.9％)，其次为CDV(16.3％,40/246,95％ CI:11.2％-21.3％),CRCoV(6.5％,16/246，95％ CI:3.3％-9.7％)和CPIV(3.7％，9/246，95％ CI:1.3％-6.0％)。不同病毒检出率无雌雄差异;75.2％的感染发生在小于12个月的幼犬，其中CCoV和CRCoV多检出在小于3个月的幼犬(P＜0.05); CCoV阳性病犬主要表现为消化道症状且以肛拭子检出为主（P＜0.05）;几种病毒的共感染情况也有检出，但数量较少。 二、犬冠状病毒基因特点分析 为了解北京地区宠物犬流行的CCoV和CRCoV基因特点，对初筛检测阳性的核酸样本进行RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA dependent RNA polymerase，RdRp)、棘突蛋白基因(Spike，S)和核基因(Nucleocapsid，N)的扩增，获得的PCR扩增产物经测序并与相关毒株序列进行比对和系统进化分析。结果表明，而本地区检出的CCoV RdRp基因在系统进化树上聚在一起，变异不大;CCoV S基因主要为CCoVⅡ型，并且表现出较高的变异性;CCoV N基因也可分为进化关系较远的两群。而本地区流行的CRCoV RdRP、S、N基因则与韩国株CRCoV-K37聚集在一群，相对保守。此外，通过二代测序结合普通PCR产物测序的方法获得了一条全长30868bp的CRCoV全基因组序列:CRCoV-BJ232，对其全基因组及主要结构基因分析发现与CRCoV-K37和BCoV参考株表现出很高的核苷酸一致性。 三、犬冠状病毒核衣壳蛋白制备及抗原性初步分析 原核表达并纯化CCoV和CRCoV核衣壳蛋白，并对重组蛋白进行初步鉴定和抗原性分析。利用RT-PCR扩增并分析CCoV-BJ70和CRCoV-BJ202的N基因全长序列，并将其克隆到原核表达载体pET-28a(+)。重组蛋白表达菌株经IPTG诱导表达后采用镍离子亲和层析和分子筛对目的蛋白进行纯化，并用SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定。序列分析发现CCoV-BJ70和CRCoV-BJ202分属不同冠状病毒群;SDS-PAGE显示CCoV和CRCoV重组N蛋白与预期大小相符，且具有较高的纯度，可达95％以上;Western blot表明CRCoV NP均能与人冠状病毒(HCoV-229E、NL63、OC43、HKU1)NP免疫的小鼠多抗血清发生反应;而CCoV NP仅能与HCoV-229E和NL63 NP免疫的小鼠血清反应;但二者均不能与MERS-CoV感染的小鼠血清反应。 结论 本研究揭示了北京地区宠物病犬CCoV、CDV、CRCoV和CPIV的流行情况，同时发现了在本地区流行的CCoV和CDV的基因多样性;获得了本地区首条CRCoV全基因组序列，系统进化分析显示其与韩国株CRCoV-K37关系较近;利用原核表达系统成功制各了高纯度的重组CCoV和CRCoVN蛋白，并评价了其与人冠状病毒的交叉反应。综上，本研究强调了对宠物病毒的监测在防治宠物病及应对新发传染病中的重要作用，也为冠状病毒在人畜间传播机制的研究提供了参考。