研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer disease, AD）是一种严重的中枢神经系统退行性疾病,严重损害患者的认知功能,造成生活自理能力的障碍和精神行为的异常。统计结果显示,65岁以上老年人中有约10%,85岁以上老年人中有50%患有该病。目前,AD的病因学和发病机制尚不清楚。AD患者脑的典型病理特征为:老年斑的形成、神经元纤维缠结和神经细胞的大量死亡。通过近几年的研究发现,很多因素在AD的发病过程中起着至关重要的作用[1],特别是对淀粉样蛋白形成、沉积和毒性的研究发现β淀粉样蛋白（ amyloid beta protein, Aβ）及其聚集形成的老年斑（senile plaques, SPs ）是阿尔茨海默病特异性病理学变化,Aβ在脑实质内沉积,是阿尔茨海默病发病机制的重要环节[2]。现在Aβ已是公认的各种病因的共同通路,Aβ有不同的存在形式。已有大量研究显示,纤维状聚集的Aβ和寡聚态Aβ具有神经毒作用,在AD的形成和发展过程中起着核心和关键作用。对于形成聚集状态前可溶性Aβ神经毒性作用报道不一。本实验通过可溶性Aβ25-35致大鼠皮层神经元损伤作用来研究可溶性Aβ的神经毒性作用及其作用机制,进一步深入探索AD的可能发病机制。目的本实验研究不同浓度的可溶性Aβ25-35对新生大鼠皮层神经元活力、钙超载、PI3K p85蛋白表达的影响,探讨可溶性Aβ25-35的神经毒性作用及作用机制。方法1、选取96孔板体外培养7天的新生大鼠皮层神经元,分别加入10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L和30μmol/L浓度的可溶性Aβ25-35,孵育24小时后,通过细胞计数试剂盒（CCK-8）实验,检测神经元活性。2、选取培养皿体外培养8天的新生大鼠皮层神经元,应用激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM） [ca²⁺]荧光成像技术实时动态分析检测[ca²⁺],即时分别加入10nmol/L、、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L和30μmol/L浓度的可溶性Aβ25-35,观察可溶性Aβ25-35对体外培养的大鼠皮层神经元内钙的影响。3、选取培养瓶培养7天的新生大鼠皮层神经元,分别加入10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L和30μmol/L浓度的可溶性Aβ25-35,孵育24小时,然后加入6nmol/L胰岛素,孵育30分钟后裂解细胞、提取蛋白,用western blot方法检测培养大鼠神经皮层神经元PI3Kp85蛋白表达。结果1、结果显示:加入10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L、10μmol/L和30μmol/L浓度可溶性Aβ25-35的大鼠皮层神经元细胞活力与对照组相比,相对细胞活力分别为98.3、88.6、75.6、63.2和59.7,100nmol/L浓度（P<0.05）,1μmol/L、10μmol/L和30μmol/L浓度（P<0.01）。呈浓度依赖,随着浓度的增高,细胞活力逐渐降低。2、结果显示,在给予10nmol/L可溶性Aβ25-35大鼠皮层神经元内[ca²⁺]无明显改变（P〉0.05）,给予100nmol/L可溶性Aβ25-35神经元[ca²⁺]紫外激发比值R由287.52±9.43升高至309.66±9.21,升高率114士4.3%（n=12 P<0.05）;给予1μmol/L可溶性Aβ25-35神经元[ca²⁺]紫外激发比值R由299.36±9.63升高至392.36±10.69（n=12 P<0.01）,升高率131.8±6.7%;给予10μmol/L可溶性Aβ25-35,神经元[ca²⁺]紫外激发比值R由278.92±8.78升高至889.76±18.99,升高率221.6±14.7%（n=12 P<0.01）;给予30μmol/L可溶性Aβ25-35神经元[ca²⁺]紫外激发比值R由289.34±10.98升高至1068.32±15.43,升高率388.6±16.8%（n=12 P<0.01）,呈浓度依赖,随着浓度的增高细胞内钙超载逐渐加剧。3、加入10nmol/L浓度的可溶性Aβ25-35大鼠皮层神经元PI3Kp85蛋白表达与对照组相比无统计学意义（P〉0.05）。加入100nmol/L浓度的可溶性Aβ25-35大鼠皮层神经元PI3K p85蛋白表达增高,与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。加入1μmol/L、10μmol/L和30μmol/L浓度的可溶性Aβ25-35大鼠皮层神经元PI3K p85蛋白表达增高,与对照组相比有统计学意义（P<0.01）。结论一定浓度的可溶性Aβ25-35可以降低培养的大鼠皮层神经元活性,可能通过导致大鼠皮层神经元钙超载和影响胰岛素信号传导通路发挥神经毒性作用。