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自“多莉”诞生以来,体细胞核移植技术在家畜中的应用的到了长远的发展。以转基因体细胞为供体细胞,利用核移植技术成产转基因家畜成为研究的热点。本研究拟构建骨骼肌特异表达胰岛素生长因子Ⅰ真核表达载体,并转染绵羊胎儿成纤维细胞,筛选出外源目的基因稳定整合的转基因细胞克隆。以转基因体细胞为核供体,通过体细胞核移植技术制备转基因胚胎,并通过胚胎移植的移入受体绵羊体内,生产转基因动物。
1.骨骼肌特异表达载体的构建
1:通过PCR克隆出猪血基因组α-actin5端调控区与绵羊IGF-1cDNA序列相连得到中间载体p19T-CI,p19T-CI经SphI+SacI酶切,得到目的片段CI,将CI连接到骨架载体pCDsReD2上,得到真核表达载体pCICDS,酶切鉴定插入是否正确:
2.人工合成肌肉特异启动子SP片段,和绵羊cDNA连接得到中间载体p19T-SPI,酶切p19T-SPI得到目的片段SPI,将SPI与骨架载体pCDsReD2相连,得到表达载体pSPICDS,并酶切鉴定。构建成功的真核表达载体均经酶切鉴定证明插入位置正确,载体构建成功。
2.绵羊成纤维细胞的体外培养及基因转染
使用组织贴壁法得到绵羊胎儿成纤维细胞,使用脂质体Lip2000TM将骨骼肌特异表达载体pSPICDS、pCICDS转入绵羊成纤维细胞基因组中。使用G418药物筛选转基因细胞,同时利用红色荧光蛋白进一步得到细胞克隆。通PCR的方法鉴定转基因细胞克隆来源胎儿性别与检测外源基因是否整合到细胞基因组中。通过绘制生长曲线与制备转基因细胞染色体核型分析,评估转基因细胞活性。结果证明获得同时具有G418抗性与表达红色荧光蛋白的细胞克隆,并鉴定出细胞性别,外源目的基因已经稳定整合入细胞基因组中,生长曲线与核型分析显示转基因细胞基本正常。表明我们得到的转基因细胞可以作为供体细胞,用于体细胞核移植实验。
3.转基因胚胎的制备与胚胎移植
通过显微操作的方法吸出成熟卵母细胞的第一极体和细胞核,将转pSPICDS、pCICDS转基因SFCs供体细胞注入卵子。通过电融合将供体细胞与去核卵母细胞进行融合,5μMIA231875min+2mM6-DMAP4hr激活方法,激活重构胚胎,并在体外发育液中进一步发育。通过PCR法鉴定转基因胚胎外源基因整合情况;使用激光共聚焦显微镜观察红色荧光蛋白的表达;挑取形态均匀的4～8细胞转基因胚胎进行胚胎移植。绵羊卵母细胞成熟率为67％,融合率为61.7％,重构胚胎卵裂率为79.5％,八细胞率为57％,囊胚率为13％。转基因胚胎外源基因稳定整合,红色荧光蛋白在转基因胚胎中表达。转基因胚胎移植27只受体母羊,怀孕4只,1只顺利出生,3只流产。