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第一部分miR-9表达水平与抑郁症的相关性研究目的:中枢神经系统疾病通常伴有严重的神经炎性反应,神经炎性反应在抑郁症的发生发展过程中发挥重要作用。实验室前期研究发现miR-9在调控神经炎性反应中发挥重要作用。生物信息学分析发现circDYM与miR-9存在结合位点。验证miR-9是否参与抑郁症,验证miR-9上游调控分子circDYM与抑郁症的相关性。方法:实时荧光定量PCR方法检测正常受试者和MDD患者的血清中miR-9表达水平。通过生物信息学分析筛选发现miR-9上游调控分子circDYM,实时荧光定量PCR方法检测正常受试者和MDD患者全血中circDYM表达水平。结果:1)正常受试者和MDD患者的血清中miR-9表达水平与年龄和性别匹配的正常对照相比,MDD患者的血清miR-9水平显著增加(P=0.0018)。同时,miR-9表达水平与汉密尔顿焦虑量表(HAMA)得分呈正相关(Pearson相关系数r=0.341,P=0.023)。进一步线性回归分析显示,miR-9表达水平越高,MDD患者表现出抑郁症状越严重。接受者操作特征(ROC)曲线的分析显示,miR-9在曲线下的显著面积(AUC)为0.757,灵敏度为0.639,特异性为0.9。2)与对照组比较,MDD患者全血中的circDYM表达水平显著降低。circDYM表达水平与TEPS-A评分成负相关;经线性回归分析发现,circDYM表达水平越低,患者抑郁症状越严重。结论:miR-9和circDYM表达水平与MDD有关,MDD患者血清中miR-9表达水平显著升高,外周血中circDYM表达水平显著降低。miR-9和circDYM可作为诊断MDD的生物标志物。第二部分 circDYM在小鼠抑郁模型中作用目的:生物信息学分析发现circDYM与miR-9存在结合位点,本部分将进一步验证circDYM和miR-9之间的关系。第一部分证实MDD患者circDYM表达水平显著下调,本部分将进一步探讨小鼠抑郁模型中circDYM的表达及其对抑郁样行为的影响,,探究circDYM/miR-9在抑郁症中作用,为circDYM成为临床上诊断MDD的新型治疗靶点提供依据。方法:利用RNA pull down实验验证circDYM特异性结合miR-9,通过将circControl-GFP慢病毒或circDYM-GFP慢病毒脑微注射到C57BL/6J小鼠的海马中来验证circDYM在小鼠抑郁模型中的作用。监测小鼠以确定circDYM在抑郁症发病机理中的作用。在脑微注射慢病毒注射后一周,将小鼠暴露于CUS方案5周或给予小鼠连续注射LPS 5天诱导抑郁样行为,然后进行抑郁行为学测试。应用实时荧光定量PCR方法测定小鼠海马脑区、血浆、全血中circDYM表达以及血清中miR-9表达。应用蛋白质免疫印迹(Western blot)方法检测海马脑区中小胶质细胞活化标志物iNOS表达。应用酶联免疫法(ELISA)方法检测小鼠海马脑区细胞因子(IL-6,IL-1β,MCP-1和TNF-α)表达水平。结果:1)在BV-2细胞上使用RNA pull down实验发现在biotin-miR9-WT捕获产物中富含circDYM,同时通过反向捕获也发现,在biotin-circDYM探针捕获产物中富含miR-9,证实circDYM特异性结合miR-9。2)抑郁行为学测试显示,CUS/LPS诱导抑郁模型小鼠的蔗糖偏好程度降低,TST和FST试验中小鼠不移动时间增加;而海马脑区脑微注射circDYM过表达慢病毒,小鼠的蔗糖偏好程度显著增加,TST和FST试验中小鼠不移动时间显著降低,提示过表达circDYM改善小鼠抑郁行为。3)Western blot方法检测在CUS/LPS诱导的小鼠抑郁模型海马脑区小胶质细胞活化标志物iNOS表达,发现与对照组比较,过表达circDYM也显著抑制CUS/LPS诱导的抑郁模型小鼠海马脑区中iNOS表达水平升高。4)ELISA方法检测小鼠海马脑区细胞因子(IL-6,IL-1β,MCP-1和TNF-α)表达水平,发现与对照组比较,过表达circDYM显著抑制CUS/LPS诱导的抑郁模型小鼠海马脑区中细胞因子(IL-6,IL-1β,MCP-1和TNF-α)表达水平的增加。结论:circDYM特异性结合miR-9,并通过调控小鼠海马脑区小胶质细胞活化改善小鼠的抑郁样行为。第三部分circDYM/miR-9/HECTD1轴通过HSP90泛素化调控小胶质细胞活化目的:小胶质细胞活化在神经炎性反应中发挥重要作用,miR-9能够调控小胶质细胞活化参与神经炎性反应。使用TargetScan生物信息学预测出miR-9与HECTD1的3’非翻译区(3’utr)存在结合位点,本部分旨在探讨circDYM靶向miR-9调控HECTD1在小胶质细胞活化的作用。方法:通过生物信息学分析筛选发现miR-9下游靶蛋白HECTD1,荧光素酶报告基因实验验证miR-9特异性结合HECTD1。应用慢病毒转染、质粒转染和小鼠脑微注射技术,结合Western blot,免疫共沉淀实验和ELISA等实验技术,在离体和整体水平上验证circDYM/miR-9/HECTD1轴对小胶质细胞活化的作用。应用Western blot在离体和整体水平上验证circDYM/miR-9/HECTD1轴对通过HSP90泛素化调节小胶质细胞活化的作用。结果:1)离体水平上,Western blot方法检测发现过表达circDYM显著抑制LPS/miR-9引起的小胶质细胞中iNOS表达上调。过表达circDYM显著抑制LPS/miR-9引起的小胶质细胞细胞因子(IL-6,IL-1β,MCP-1和TNF-α)表达水平增加。2)miR-9与HECTD1的3’UTR存在结合,miR-9抑制HECTD1表达。3)过表达HECTD1显著抑制LPS/miR-9引起的小胶质细胞iNOS表达上调。ELIS A方法检测过表达HECTD1显著抑制LPS/miR-9引起的小胶质细胞细胞因子(IL-6,IL-1β,MCP-1和TNF-α)表达水平增加。4)Western blot方法检测发现过表达circDYM显著抑制LPS/miR-9引起的小胶质细胞中HECTD1表达下调,而且过表达circDYM显著抑制CUS/LPS抑郁模型小鼠的海马脑区HECTD1表达下调。5)离体水平上,HECTD1与HSP90特异性结合,Western blot方法检测发现过表达HECTD1以及circDYM显著抑制LPS引起的泛素化蛋白Ub-K63表达下调。而且过表达circDYM增加CUS/LPS抑郁模型小鼠的海马脑区泛素化蛋白Ub-K63与HSP90结合,从而抑制泛素化蛋白Ub-K63下调,抑制HSP90升高。结论:过表达circDYM能够调控HSP90的泛素化修饰。circDYM/miR-9/HECTD1轴通过HSP90的泛素化修饰调控小胶质细胞活化。circDYM未来可能成为临床上神经炎性相关疾病诊断的新型生物标志物与分子治疗靶点。