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鸡蛋过敏是婴幼儿和儿童多发的食物过敏反应,至少0.5%-2.5%的婴幼儿和儿童对鸡蛋过敏。卵转铁蛋白是公认的五大鸡蛋过敏原之一,它在蛋清蛋白中含量占第二,被大约22%的鸡蛋过敏患者所识别。卵转铁蛋白导致过敏的机理目前尚不完全清楚,主要原因是缺乏对其致敏表位的认识。由于目前商品化的卵转铁蛋白含有杂质且价格昂贵,如何简单、快速、低廉地大量纯化出卵转铁蛋白是深入开展卵转铁蛋白过敏研究的关键。因此,本论文工作首先探索建立一步离子层析法制备高纯度卵转铁蛋白的方法,然后通过免疫新西兰大白兔制备抗卵转铁蛋白的兔血清,并利用制备的抗卵转铁蛋白兔血清和鸡蛋过敏患者血清对分离纯化的卵转铁蛋白的抗原性和过敏原性进行评估。随后,以纯化的兔多克隆抗体为靶分子,利用噬菌体随机七肽库对卵转铁蛋白线性模拟表位进行淘选和表征,模拟出卵转铁蛋白的线性模拟表位存在的区域；再通过生物信息学分析,先借助DNAStar软件和网络服务器ExPASy对卵转铁蛋白的线性表位进行预测,接着将卵转铁蛋白的氨基酸序列与在线过敏原数据库ADFS中已报道的其它过敏原蛋白的IgE结合表位进行比对,找出可能的IgE结合表位区,最后将二者的预测结果以及淘选到的卵转铁蛋白模拟表位结果综合分析,找出最有可能的卵转铁蛋白线性表位。另外,通过对卵转铁蛋白热加工处理,探讨热加工对卵转铁蛋白结构与过敏原性的影响,探索卵转铁蛋白过敏原性变化的影响因素,为进一步开展低过敏性或无过敏性的蛋制品加工提供理论和技术依据,主要研究结果及结论如下。1.建立了DEAE-Sepharose Fast Flow一步离子层析方法从蛋清中分离卵转铁蛋白的方法。该方法操作简单,经济方便,分离效率高,卵转铁蛋白得率为87.47%,纯度高达97%(SDS-PAGE),纯化出的卵转铁蛋白可为进一步研究提供优质的实验材料。2.较全面地表征了分离纯化的卵转铁蛋白的理化性质和免疫学性质,该蛋白分子量为77,726 Da,等电点为6.85,具有完整的蛋白结构,能够与特异性IgG和IgE强烈结合。3.制备出了高效特异的抗卵转铁蛋白的兔多克隆抗体,抗体效价均在1：80万以上。间接ELISA、竞争抑制ELISA以及Western blotting的(?)实验结果表明,本研究分离纯化的卵转铁蛋白保持了完好的抗原性和过敏原性,此结果也进步证实了本研究所建立的一步法分离纯化卵转铁蛋白方法的可靠性。4.建立了亲和层析纯化抗卵转铁蛋白特异性IgG的方法。采用溴化氰活化的Sepharose4B免疫亲合层析介质,按5mg/mL层析介质的量将纯化的卵转铁蛋白耦联到层析介质上,然后经过3mol/L MgCl2特异性洗脱兔血清IgG抗体,得到了SDS-PAGE纯的IgG, ELISA检测抗体效价滴度为1:20万。5.以纯化的特异性兔IgG抗体为探针,对噬菌体随机七肽库进行亲和淘选,通过对淘选到的274个阳性克隆子测序、Clustalx序列比对分析,最终筛选到鸡蛋卵转铁蛋白IgG结合的17个主要线性模拟表位,分别是AA1-3、AA138-140、AA214-219、AA292-295、AA306-312、AA318-320、AA322-325、AA392-394、AA415-418、AA444-445、AA464-468、AA479-484、AA531-533、AA568-570、AA592-596、AA625-628及AA660-662。6.利用生物信息学,借助DNAStar软件和网络服务器ExPASy,通过对卵转铁蛋白的抗原性指数、亲水性、表面可及性、柔韧性及其二级结构等多参数预测的结果进行综合分析,预测得到鸡蛋卵转铁蛋自可能的17个线性表位,分别是AA13-16、AA85-90、AA174-181、AA215-222、AA231-240、AA256-258、AA277-280、AA288-294、AA332-344、AA415-429、AA438-442、AA491-495、AA517-519、AA547-555、AA598-600、AA619-622和AA648-652。7.通过将卵转铁蛋白的氨基酸序列与过敏原数据库ADFS中已报道的98个过敏原的已知IgE结合表位序列进行比对,预测到45个鸡蛋卵转铁蛋白可能的IgE结合表位。8.将基于软件和网络服务器预测的卵转铁蛋白线性表位和基过敏原数据库预测的IgE结合表位与噬菌体展示技术筛选到的卵转铁蛋白线性模拟表位结果分别比对分析,初步定位出14个可能的卵转铁蛋白人源IgE结合表位以及3个可能的卵转铁蛋白兔源IgG结合表位,同时还预测到10个卵转铁蛋白IgG和IgE共同结合的表位。9.通过园二色谱、紫外光谱和荧光光谱表征加热前后卵转铁蛋白结构的变化,以及ELISA结果表征其相应过敏原性变化,基本阐明了加热处理后鸡蛋过敏原卵转铁蛋白结构变化与过敏原性的关系。加热后卵转铁蛋白的过敏原性随着其结构的展开和疏水基团的暴露而增强,又因其分子内二硫键的断裂和重排而减弱。10.热加工的强度影响卵转铁蛋白结构和过敏原性的改变,热加工的程度以及鸡蛋过敏患者对鸡蛋不同程度的耐受决定着该处理方法是否具有降低过敏原性的效果。通过控制鸡蛋热加工中的温度和时间参数,可能可以制备低过敏的蛋制品,为部分鸡蛋过敏患者所耐受。