细胞内无处不在的Ca2+在细胞周期、生长、凋亡、迁移、兴奋收缩和基因表达等基本的生理过程中发挥重要的作用。细胞内Ca2+稳态的调节受到胞外通过钙通道进入的Ca2+和胞内钙库释放的Ca2+的影响，而且许多疾病的发生都与不正常的Ca2+震荡有关，包括进行性疾病，心血管疾病，神经退行性疾病和癌症等。　　细胞膜上的 Ca2+通道主要包括电压门控性钙通道(VGCC)、钙库操纵性钙通道(SOCE)、配体门控性钙通道(LGCC)、钠钙交换体（NCX)、受体操纵性的钙通道(ROCE)和花生四烯酸调控性钙通道(ARC)等。其中 SOCE是介导胞外Ca2+进入细胞内的重要通道之一,其核心蛋白由位于内质网膜上的基质相互作用分子(STIM)和位于细胞膜上的Orai/TRPC蛋白构成。静息时STIM1会均匀分布在内质网（ER）膜上，一旦钙库排空，ER膜上的STIM1可以感知ER内Ca2+浓度的变化，紧接着，STIM1分子会自身聚集偶联位移至细胞膜内侧，与胞膜上四次跨膜的蛋白Orai1和六次跨膜的TRPCs偶联激活钙库操纵的Ca2+通道，伴随的就是Orai/TRPCs通道开放，使细胞外的Ca2+通过Orai/TRPCs大量涌入到细胞内，这就是SOCE的激活过程。　　研究指出，许多癌症中普遍发现STIM1的表达水平与肿瘤大小和临床诊断结果相关。研究指出乳腺癌中，STIM1表达的高低与肿瘤大小和转移能力直接相关，干扰STIM1的表达会引起Ca2+内流紊乱，抑制癌细胞增殖，影响下游的细胞周期调控蛋白CDC25C并且上调抗增殖蛋白p21。在SiHA细胞中引入外源的STIM1，在裸鼠试验中，与正常对照组相比，过表达STIM1会引起肿瘤细胞增殖加快，STIM1蛋白表达高低确实和肿瘤生长存在正相关。通过比较295例乳腺癌病人中STIM1的表达也发现相似的情况，并且在乳腺癌幸存的患者中，原来高表达的STIM1在mRNA水平也急剧下降。这些数据表明，STIM1在肿瘤发生和发展过程中可能扮演重要角色。大量研究指出在乳腺癌，结肠癌，宫颈癌，肝癌，鼻咽癌，胃癌，胶质瘤，黑素瘤等众多癌症中下调STIM1/Orai1都可以抑制肿瘤生长，并且引起肿瘤细胞凋亡。　　膀胱癌是泌尿系统较常的的恶性肿瘤，发病几率位居泌尿系统恶性肿瘤前列，并以高度增殖高转移为主要特征。目前公认的致病原因较统一，主要集中在病毒或者某些化学因素作用于机体，造成原癌基因激活成癌基因。细胞生长，增殖和转移等都与离子通道密切相关，尤其是SOCE在其中的作用显而易见。除了调控生长，增殖，迁移和转移以外，许多研究指出STIM1在癌症中也会影响肿瘤转移，许多基因改变都会影响STIM1的表达水平，进而影响细胞生长，增殖和转移等。SOCE活性高低直接反映STIM1，Orai1和TRPCs的活性，沉默STIM1的直接结果就是下调SOCE，如果使用SOCE的抑制剂2-APB，SKF96365，Gd3+和AnCoA4，那么如果采用MTT技术，检测细胞在2-APB，SKF96365，Gd3+和AnCoA4等作用下增殖情况就间接可以反映SOCE在肿瘤细胞发生发展中的作用，也有报道指出使用2-APB和SKF96365等药物可以抑制胶质瘤生长。所以想探究STIM1在膀胱癌细胞系EJ细胞中的作用。　　1.人膀胱癌细胞系EJ细胞中组成SOCE相关蛋白STIM1, Orai1和TRPC1/3/5/6/7在mRNA水平的表达情况。为了检测人膀胱癌细胞系EJ细胞中是否存在SOCE，首先检验SOCE的组成蛋白在mRNA水平是否有表达及表达高低。首先以人肾上皮细胞系HEK293细胞的mRNA为阳性参照，在HEK293及HEK293细胞中转染质粒TRPC5/7为阳性参照，通过RT-PCR检测对应蛋白不同退火温度下mRNA表达水平，确定最佳退火温度。在同样条件下，分别使用 STIM1， Orai1和TRPC1/3/4/5/6/7/GAPHD的特异性引物，获得EJ细胞对应的PCR产物，通过分子筛的原理，通过比较产物大小确定相关基因表达情况，最终确定EJ细胞中STIM1,Orai1和TRPC1/3/6/7的表达情况，并且通过Western blot互补RT-PCR结果，确认STIM1的表达情况。　　2.人膀胱癌细胞系EJ细胞中明显存在SOCE。为了证实人膀胱癌细胞系EJ细胞中确实存在SOCE，本实验紧接着拟用2μmol/L Tg（Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ATPase不可逆性抑制剂）处理人膀胱癌细胞系EJ，Tg是SERCA泵不可逆性抑制剂，导致泵入钙库的Ca2+减少，打破了ER膜上钙离子稳态，促使钙库的Ca2+释放到细胞质，以模拟生理条件下钙库耗竭，再通过钙成像（calcium imaging）技术检测EJ细胞在Tg作用下细胞外Ca2+通过Orai1和TRPCs进入细胞内浓度的变化。实验显示EJ在2μmol/L Tg刺激后钙库排空，可产生明显的细胞内Ca2+升高，紧接着胞外加钙并同时应用SOCE的抑制剂2-APB, Gd3+后，Ca2+内流明显降低，这说明EJ细胞中存在钙库操纵的Ca2+内流即SOCE。　　3.采用慢病毒包装的shSTIM1构建沉默STIM1的稳转细胞系。希望研究SOCE与人膀胱癌细胞生长的关系，我们知道癌细胞的主要特征就是高度繁殖，易转移。作为胞内的第二信使Ca2+的作用显得尤为重要，参与胞吐作用、细胞活动性、酶活性、钙振荡、肌收缩、基因转录、细胞增殖、炎症反应、凋亡和癌变等。所以希望通过沉默STIM1，下调SOCE观察STIM1对EJ细胞生长的影响。　　ShSTIM1作为质粒需要转染进入细胞才能起作用，为了检测STIM1转染进入EJ细胞的高低，将YFP荧光标签质粒转入EJ细胞，通过免疫荧光法发现，EJ细胞转染效率较低。为了提高质粒转入细胞的效率，本实验确定使用慢病毒包装的shSTIM1感染EJ细胞，为了达到较好的沉默效果。检测沉默前后STIM1的蛋白表达水平就可以反应shSTIM1沉默效率。SOCE激活时ER膜上STIM1位移至胞膜内侧，通过calcium imaging技术检测发现，与mock组相比，shSTIM1组Tg介导的Ca2+内流明显降低。通过western blot和calcium imaging技术双重确定选择性沉默STIM1的稳转细胞系构建成功。　　4.沉默STIM1下调SOCE使EJ细胞活力减慢和凋亡。细胞凋亡是一个复杂的过程，普遍存在于病理生理状态下，首先就是胞浆，线粒体，细胞体积的皱缩，其次，细胞核断裂成大小不一的片段，最后就会出现凋亡小体被巨噬细胞吞噬等现象，所以我们通过检测凋亡相关指标就会发现沉默STIM1以后对EJ细胞的影响。Bcl-2是抗凋亡蛋白即是保护性蛋白，当细胞某种基因改变时Bcl-2减少，相应的Bax表达上调，那通过Bcl-2/Bax的比值就可以判断沉默STIM1对EJ细胞的影响。并且通过JC-1染色可以验证早凋时线粒体膜电位变化，因为线粒体膜电位降低，就不能将JC-1聚集在线粒体内。同样因为沉默STIM1会抑制SOCE的水平，那通过MTT检测EJ细胞在使用SOCE抑制剂2-APB，SKF96365, Gd3+, AnCoA4等时，因为下调SOCE同样会引起EJ细胞活力减慢。　　5.选择性沉默STIM1下调SOCE减慢EJ细胞迁移和成瘤能力。细胞迁移也称为细胞爬行或细胞运动，是细胞在接受信号后的正常生理表现，划痕试验和平板成瘤实验可以检测某个基因对肿瘤细胞生理状态的影响，比较直观。细胞克隆形成实验是细胞接种成活率检测实验，直观反应细胞接种以后贴壁成活并且形成克隆的数量，因为贴壁以后的细胞并不是所有单个细胞都具有增殖和形成克隆的能力，所以严格意义上说克隆形成实验反应的是群体细胞依赖性和增殖能力。发现与对照组相比，选择性沉默STIM1组确实观察到明显的EJ细胞迁移减慢，成瘤能力降低。　　6.沉默STIM1下调SOCE抑制AKT磷酸化。理论上，胞外信使激活G蛋白偶联受体（GPCRs）,活化的PLC水解PIP2生成IP3（三磷酸肌醇）和DAG（二酰基甘油），IP3可以引起钙库排空，激活SOCE。膀胱癌的发展是多阶段，复杂的生理过程，涉及原癌基因和抑癌基因，信号通路和细胞周期蛋白的失衡。虽然AKT在肿瘤中研究较多，但是，AKT和pAKT在膀胱癌的发生发展研究较少。所以，有必要进行下一步沉默STIM1以后对AKT的影响。