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禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)是养禽业最常见的致病菌之一,可感染鸡、鸭、火鸡和其他禽类,可引起禽类严重的呼吸道和全身性感染,对养禽业造成重大损失。APEC严重的耐药性和复杂的血清型,严重制约该病的防控。 密度感应(Qurom Sensing,QS)是细菌通过自身产生小分子自诱导物来协调群体行为的过程。LuxS/AI-2型密度感应系统广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌中,它通过小分子自诱导物AI-2来调节细菌的许多生理功能。信号分子AI-2发挥其调控作用,需要借助AI-2受体和相关的转运蛋白将其由胞外转运至胞内。本实验室前期研究表明,大肠杆菌MG1655可以通过lsrB基因内化AI-2,但不同于大肠杆菌MG1655,禽致病性大肠杆菌DE17(O2血清型)也可以内化AI-2,但不存在lsrB样基因,因此推测DE17可能存在不同于lsrB基因的其他基因参与APEC对AI-2的内化。经生物信息分析,本研究选取可能参与AI-2内化的磷酸烯醇丙酮酸盐磷酸转移系统(PTS)中的ptsⅠ(phosphoenolpyruvate-protein phosphotransferase)基因和ABC操纵子中的1633(riboseABC transporter permease)基因,并开展了ptsⅠ和1633对AI-2内化、APEC致病性以及生物被膜形成的影响研究,以期为从群体感应角度开展禽致病性大肠杆菌防控提供参考。 1.禽致病性大肠杆菌ptsⅠ缺失株的构建及其对AI-2内化的影响 利用red重组技术构建APEC的ptsⅠ缺失株DE17ΔptsⅠ和1633缺失株DE17Δ1633,运用报告菌株哈维弧菌BB170对野生株DE17和缺失株DE17ΔptsⅠ、DE17Δ1633进行AI-2内化动力学检测,结果表明与野生株DE17相比DE17ΔptsⅠ对AI-2的内化提前4h,而DE17Δ1633基因缺失后与野生株相比没有差异。 为了验证PtsⅠ是否具有AI-2结合活性,本研究构建了pET28a-PtsⅠ表达载体,在大肠杆菌BL21ΔluxS(DE3)宿主菌中,以可溶性方式表达了大小为63.5 KD的PtsⅠ重组蛋白。在浓度为1mg/ml的重组蛋白PtsⅠ中,加入终浓度为33μM的AI-2,37℃孵育1h后检测PtsⅠ与AI-2的结合与释放,结果表明重组蛋白PtsⅠ并不能结合AI-2。本研究表明PTS系统中的ptsⅠ基因可能参与AI-2的内化,但不具有AI-2结合活性。 2.ptsⅠ基因对禽致病性大肠杆菌致病性的调控作用 对缺失株DE17ΔptsⅠ与野生株DE17的生物学特性分析表明,ptsⅠ基因缺失不影响其生长特性;对7日龄樱桃谷鸭攻毒统计各菌株半数致死量,结果表明野生株DE17的LD50值为1.24×103CFU,而缺失株DE17ΔptsⅠ的LD50值为2.21×104 CFU,与野生株DE17相比,缺失株DE17ΔptsⅠ的毒力下降了约17.8倍。 分别用野生株、缺失株以2.0×106 CFU的剂量对7日龄樱桃谷鸭进行攻毒,24 h后统计细菌在血液和脏器中的载菌量,结果表明:肝脏中的载菌量野生株DE17(4.5×108 CFU/g)是缺失株DE17ΔptsⅠ(3.3×104 CFU/g)的13600倍(P<0.05);脾脏中的载菌量野生株DE17(2.4×108 CFU/g)是缺失株DE17ΔptsⅠ(3.5×106 CFU/g)的68倍(P<0.05);肾脏中的载菌量野生株DE17(3.8×108 CFU/g)是缺失株DE17ΔptsⅠ(2.9×106 CFU/g)131倍(P<0.05),而1 mL血液中的载菌量野生株DE17(2.5×108 CFU/ml)是缺失株DE17ΔptsⅠ(6.9×104 CFU/ml)的362倍(P<0.05)。 对7日龄樱桃谷鸭以2.0×106 CFU的剂量分别用野生、缺失株进行攻毒,24h后解剖,取其肝、脾、肾制作病理切片,野生株DE17病变明显,局部心肌细胞条索状坏死,肝细胞空泡变性,脾脏淋巴细胞减少,肾小管部分上皮细胞水肿;相比于野生株DE17,缺失株DE17ΔptsⅠ在心肌细胞中、肝细胞、脾脏组织和肾小管部分的病变程度都较轻。 对DF-1细胞的粘附入侵实验结果表明,缺失株DE17ΔptsⅠ的黏附能力是(6.9×106CFU/孔)野生株DE17的黏附能力(3.4×104 CFU/孔)2倍(P<0.05),但野生株DE17(4.5×104 CFU/孔)与缺失株DE17ΔptsⅠ(4.0×104 CFU/孔)对DF-1细胞的入侵能力无明显差异。 本研究结果表明,ptsⅠ基因对禽致病性大肠杆菌致病性的具有调控作用。 3.ptsⅠ基因对生物被膜的调控作用 细菌生物被膜(Biofilm)是细菌粘附于物质表面,并通过胞外基质包裹具有严密结构性的多细胞群体形态,细菌生物被膜形成与其致病性和运动性相关。本研究开展了ptsⅠ和1633基因的缺失对APEC生物被膜形成影响研究。结果表明,缺失株DE17ΔptsⅠ与野生株DE17相比生物被膜形成能力显著下降(P<0.0001),缺失株DE17Δ1633与野生株DE17相比生物被膜形成能力没有差异。在刚果红半固体平板上验证运动性变化,实验结果显示缺失株DE17ΔptsⅠ和DE17Δ1633与野生株DE17相比运动性下降(P<0.05)。观察ptsⅠ缺失后对细菌形态的变化,结果显示ptsⅠ基因的缺失使得DE17的菌落颜色由白变为深红,并且形态变小。通过SYTO/PI染料对野生株和缺失株的生物被膜进行染色,研究生物被膜形成过程中死活菌的比例,结果显示在18h时,生物被膜形成能力最强,活菌比例最高。为了进一步研究生物被膜的形态结构,本研究对37℃培养18h的DE17及缺失株DE17ΔptsⅠ的生物被膜进行扫描电镜观察,结果显示,DE17的生物被膜结构包含了各种通道结构,表面含有大量的胞外基质,而缺失株DE17ΔptsⅠ与野生株DE17相比生物被膜变得稀疏,胞外间质减少,通道结构破坏。 本研究结果表明ptsⅠ基因不是AI-2的受体基因,缺失后是APEC毒力下降,影响细菌生物被膜的形成,为进一步从APEC生物被膜角度开展该病的防控提供新思路。