【摘 要】
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背景:神经元异常同步化放电导致的反复自发性发作是癫痫最重要的临床表现之一。神经元电活动的快速转化主要由离子通道或突触传递的可逆性修饰调控,而磷酸化修饰是中枢神经系统内最主要的可逆性修饰调控系统,除维持神经元正常电活动外,磷酸化/去磷酸化失调会导致神经元异常放电甚至癫痫持续状态。丝/苏氨酸蛋白磷酸酶是哺乳动物体内最重要的磷酸酶,在脑中,半数以上的磷酸化/去磷酸化过程由丝/苏氨酸蛋白磷酸酶介导,而丝/
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背景:神经元异常同步化放电导致的反复自发性发作是癫痫最重要的临床表现之一。神经元电活动的快速转化主要由离子通道或突触传递的可逆性修饰调控,而磷酸化修饰是中枢神经系统内最主要的可逆性修饰调控系统,除维持神经元正常电活动外,磷酸化/去磷酸化失调会导致神经元异常放电甚至癫痫持续状态。丝/苏氨酸蛋白磷酸酶是哺乳动物体内最重要的磷酸酶,在脑中,半数以上的磷酸化/去磷酸化过程由丝/苏氨酸蛋白磷酸酶介导,而丝/苏氨酸蛋白磷酸酶活性又受丝/苏氨酸蛋白磷酸酶调节亚基家族调控。PPP2R3C属于丝/苏氨酸蛋白磷酸酶调节亚基家族,其在脑内有较丰富的表达并与神经系统疾病有关,但PPP2R3C对神经元电活动的影响,以及其是否参与癫痫发作的病理生理机制尚不清楚。实验目的:探讨PPP2R3C对神经元电活动及癫痫发作的影响。实验方法:1.通过蛋白免疫印迹及免疫荧光染色法检测PPP2R3C在颅内的表达和定位。2.通过串联质谱法寻找PPP2R3C互作蛋白并进行生物信息学分析。3.使用全细胞膜片钳技术检测PPP2R3C对神经元固有兴奋性、兴奋性/抑制性突触传递及AMPA/NMDA电流的影响。4.通过蛋白免疫印迹技术检测总蛋白和膜蛋白中APMA各亚基的变化。5.通过蛋白免疫印迹和免疫荧光法检测PPP2R3C在癫痫患者术后脑组织和癫痫动物模型脑组织中的表达和定位。6.使用腺相关病毒特异性干预海马神经元中PPP2R3C后造模,通过连续视频检测和场电位观察癫痫小鼠行为学变化。实验结果:1.PPP2R3C主要在成年小鼠皮层、海马、纹状体等部位表达且主要与神经元共定位。2.串联质谱共检测出656个互作蛋白,KEGG生物信息学分析显示PPP2R3C与谷氨酸突触传递通路有关。GO功能富集提示PPP2R3C最主要的功能是转运,并主要定位在细胞骨架、质膜和细胞核上。3.海马CA1区锥体神经元全细胞膜片钳结果显示,与对照组比较,过表达或抑制PPP2R3C会导致微小兴奋性电流（mEPSC）幅值显著增加或降低,但不影响mEPSC的频率和配对脉冲比（PPR）。干预PPP2R3C不影响微小抑制性电流（mIPSC）的频率和幅值及神经元固有兴奋性（诱发AP）。使用药理学方法进一步分离兴奋性突触后AMPA和NMDA电流,结果显示过表达或抑制PPP2R3C会导致AMPA电流幅值改变,但不影响NMDA电流的幅值。4.蛋白免疫印迹结果显示,干预PPP2R3C不影响AMPA受体的四个亚基GluA1-4的总表达量,进一步提取细胞膜蛋白,结果显示抑制PPP2R3C导致细胞膜上GluA1表达量显著减少,过表达PPP2R3C导致细胞膜上GluA1表达量显著增多,而干预PPP2R3C并不影响GluA2-4的膜表达量。5.PPP2R3C在癫痫患者脑组织和海人酸小鼠海马中均显著下降且主要与神经元共定位。6.对癫痫动物模型的行为学监测和场电位记录发现,抑制PPP2RC3可以延长首次癫痫发作出现的潜伏期并减少癫痫发作频率和累积发作时长;相反,过表达PPP2R3C会缩短癫痫潜伏期并增加发作频率和累积发作时长。实验结论:PPP2R3C在中枢神经系统有重要的生理及病理作用,其通过调节突触后膜上GluA1受体的分布影响兴奋性突触传递,并具有调节癫痫发作易感性的作用。
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