[背景和目的]在所有恶性肿瘤中肺癌的发病率和死亡率一直以来均居全球首位,虽然目前由于肺癌早诊早治的普及以及治疗技术的不断完善,IA期肺癌的5年总生存期（Overall survival,OS）逐渐接近100%,但肺癌总体的5年总生存期仍然仅有30%左右。因此,目前亟需根据肺癌的分子特征和免疫特征,研发更有效的治疗方法或药物,降低肺癌的死亡率。肿瘤免疫治疗的快速发展,特别是针对负性免疫的靶向干预治疗研究的突破,催生了一系列里程碑式免疫治疗新方法和新药;大大改善了肿瘤治疗的预后,也为肺癌的治疗提供了新策略。而T细胞免疫疗法近年来逐渐成为研究热点,其中肿瘤浸润淋巴细胞.（Tumor-Infiltrating Lymphocytes,TIL）是当前最有研发前景的细胞免疫治疗方法之一。Rosenberg教授首先证实,肿瘤特异性的TIL治疗转移性黑色素瘤的临床有效率大于50%,然而TIL治疗非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）方面却迟迟未能获得较大进展,主要原因是肿瘤免疫抑制微环境的限制作用。因此如何在TIL治疗的同时克服肿瘤局部和整体免疫微环境的免疫抑制,是当前肿瘤免疫治疗研究的热点领域。有研究表明沉默细胞因子信号传导抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling 1,SOCS1）可促进树突状细胞（dentritic cell,DC）分泌大量活性细胞因子,激活T细胞活化的“第三信号”系统,重塑肿瘤免疫微环境,增强DC细胞抗肿瘤疗效,而SOCS1是广泛表达于免疫细胞（DC细胞、T细胞等）的负性调节分子,由此,我们推测沉默SOCS1的TIL有可能具有逆转肿瘤局部免疫抑制作用。同时有研究表明,TIL细胞治疗与免疫检查点抑制剂联合应用,具有协同增效作用,而肺癌组织TIL高表达Tim-3,因此我们推测沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗可通过解除肺癌患者体内局部和整体的免疫抑制状态从而提高其治疗肺癌的疗效。本研究第一部分第一章节通过免疫组化检测TIL在NSCLC癌组织中的浸润程度,统计分析TIL在癌组织中的浸润程度与NSCLC临床特征相关性及预后相关性,第二章节通过检索数据库得到45篇相关文献进行荟萃分析,旨在评估TIL各亚群在NSCLC中的预后价值及作用;第二部分主要通过分离和提取肺癌组织及外周血中的TIL在体外进行培养,随后通过慢病毒转染TIL建立沉默SOCS1的TIL细胞株,在细胞层面探究沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗提高对NSCLC细胞株杀瘤活性的机制及其免疫微环境的变化情况;第三部分主要通过动物实验验证沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗通过解除小鼠移植瘤模型局部和整体的免疫抑制重塑免疫微环境提高其免疫活性及杀瘤活性。[方 法]（1）通过免疫组化检测TIL在NSCLC癌组织中的浸润程度,统计分析TIL在癌组织中的浸润程度与NSCLC临床特征相关性及预后相关性;（2）通过检索PubMed、EMBASE和Web of Science数据库收集TIL与非小细胞肺癌预后相关文献。采用随机或固定效应模型合并风险比（hazard ratios,HR）及其95%置信区间（95%confidence intervals,95%CI）,以评估TIL与非小细胞肺癌患者生存指标之间的关系;（3）选取2019年4月1日至2020年9月1日于云南省肿瘤医院胸外二科初诊肺癌手术患者,在手术中取下标本后取新鲜肺癌组织。严格按照无菌操作原则,切取新鲜肺癌组织1cm3左右大小,将肺癌组织放入装有无血清的X-VIVO培养基的10ml离心管中,将离心管放入4℃冰盒中;外周血标本通过采集患者静脉血15ml置于无菌抗凝管中,将抗凝管放入4℃冰盒中,30min内转移至超净工作台中进行分离实验;（4）TIL分离实验:通过Ⅳ型胶原酶消化离心得到TIL悬液后,Ficoll密度梯度离心液离心得到TIL;（5）TIL细胞培养及活化扩增:用含10%人灭活AB型血清的X-VIVO免疫细胞培养基,添加1000U/mL IL-2、CD3 McAb、CD28 McAb、rhIFN-γ、IL-2 等磁珠及细胞因子重悬细胞,进行细胞计数,接种于25cm2细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2培养箱进行培养;（6）流式检测:PBS重悬TIL细胞,每管加入5μl流式抗体,混匀后室温避光孵育30min,流式细胞分选仪下检测细胞荧光表达情况。（7）ELISA检测:ELISA试剂盒分别设空白孔、标准品孔、待测样品孔。空白孔不加样品及酶标试剂,其余各步骤操作按说明书进行,使用ELISA calc软件根据标准品浓度和OD值做出标准曲线并计算回归方程,根据所得回归方程即可算出待测样本中细胞因子的含量。（8）CCK8法检测杀瘤活性:接种肺癌细胞及不同类型的TIL细胞,培养48h后每孔加入10μl CCK8试剂,培养箱内孵育2h后酶标仪450nm波长下检测吸光度。TIL细胞杀瘤活性=[1-（实验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD-空白孔OD）]×100%。（9）慢病毒转染:合成SOCS1引物,构建慢病毒,转染TIL细胞48h后,PCR检测干扰效率,构建SOCS1沉默稳定株,收集细胞提取RNA,RT-qPCR检测SOCS1 mRNA表达水平,Western blot检测SOCS1蛋白表达,流式及ELISA检测沉默SOCS1的TIL对免疫微环境的影响。（10）流式及ELISA检测沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗对免疫微环境的影响,CCK8法检测沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗对NSCLC细胞株杀瘤作用的影响。（11）构建小鼠肺癌皮下移植模型:将Lewis肺癌细胞接种于BALB/c小鼠皮下,肿瘤长至约20mm3,开始治疗,通过HE染色确定移植瘤病理形态,流式及ELISA检测小鼠体内免疫微环境变化情况。第一部分TIL浸润程度与非小细胞肺癌患者预后相关性的初步探究第1章TIL浸润程度与非小细胞肺癌患者临床及预后相关性研究[结 果]（1）通过对176例NSCLC患者癌及癌旁组织的免疫组化结果显示,在176例NSCLC癌组织中,TIL 阳性浸润59例,阴性浸润117例;在176例NSCLC癌旁肺组织中,TIL 阳性浸润125例,阴性浸润51例,经统计学分析,p=0.009,差异有统计学意义。结果提示TIL在癌组织中浸润程度低于癌旁肺组织中的浸润程度,在NSCLC患者癌组织中免疫微环境可能处于抑制状态。（2）通过对176例NSCLC癌组织标本TIL浸润程度和其对应的临床基本信息进行相关分析,结果显示TIL的浸润程度与肿瘤大小及分期相关,肿瘤病灶越小癌组织中TIL浸润程度越高（p=0.017）,分期越早癌组织中TIL浸润程度越高（p＜0.001）,差异有统计学意义,而TIL的浸润程度与组织类型、性别、年龄、淋巴结转移情况无显著相关性,差异未见统计学意义。（3）对176例NSCLC患者随访3年,收集患者总生存时间,通过GraphPad Prism 8软件进行生存分析,结果显示癌组织中TIL浸润程度高的非小细胞肺癌患者其总生存期较TIL浸润程度低的患者总生存期长,HR=0.625,95%CI（0.414,0.942）,p=0.025,差异有统计学意义。[结 论]（1）TIL在肺癌组织中浸润程度较肺组织中低,提示在肺癌组织中免疫微环境有可能处于抑制状态。（2）TIL在非小细胞肺癌癌组织中的浸润程度与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小和分期呈负相关,而TIL在非小细胞肺癌组织中的浸润程度与患者的组织类型、性别、年龄、淋巴结转移情况无显著相关性。（3）预后分析结果提示癌组织中高浓度TIL浸润是非小细胞肺癌患者预后的良好生物标志物。第2章不同TIL亚群对非小细胞肺癌患者预后价值的研究[结 果]（1）本研究共纳入45篇相关文献包括11448例肺癌患者。合并分析结果显示,高密度的TIL浸润提示非小细胞肺癌患者有更好的总生存期（HR=0.80,0.70-0.89）,无进展生存期（HR=0.73,0.61-0.85）。（2）癌组织中高密度CD3+TIL浸润提示非小细胞肺癌患者有更好的总生存期（HR=0.84,0.69-0.99）和疾病特异生存率（HR=0.57,0.34-0.80）。（3）癌组织中高密度CD4+TIL浸润提示非小细胞肺癌患者有更好的总生存期（HR=0.86,0.76-0.96）。（4）高密度CD8+TIL浸润提示非小细胞肺癌患者有更好的总生存期（HR=0.995,0.99-1.0）,无进展生存期（HR=0.52,0.34-0.71）,无病生存期（HR=0.64,0.43-0.85）,无复发生存期（HR=0.42,0.18-0.67）和疾病特异生存期（HR=0.56,0.35-0.78）。（5）癌组织高密度CD20+TIL浸润提示非小细胞肺癌患者有更好总生存期（HR=0.65,0.36-0.94）。（6）肿瘤间质高密度Foxp3+TIL浸润提示非小细胞肺癌患者有更差的无复发生存期（HR=1.90,1.05-2.76）。本研究没有发现发表偏倚。[结 论]（1）研究结果证实,癌组织中高密度的TIL、CD3+TIL、CD4+TIL、CD8+TIL和CD20+TIL浸润是非小细胞肺癌生存独立的良好预后生物标志物。（2）肿瘤间质高密度Foxp3+TIL浸润是独立的不良预后标志物。第二部分沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗对非小细胞肺癌细胞系杀伤作用的机制研究[结 果]（1）流式检测TIL细胞培养前和培养后（2-3周左右）其CD3+、CD4+、CD8+T细胞比率,结果显示通过体外培养后TIL细胞中CD3+、CD4+、CD8+T细胞比率均有升高,而CD8+T细胞比率升高最为显著,由20.15%上升至50.24%,p＜0.01,差异有统计学意义,结果提示经过培养后,TIL细胞的免疫活性显著增强。（2）通过酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）实验鉴定TIL细胞培养前和培养后上清中细胞因子的水平,结果显示,经过体外培养后促进免疫活性的细胞因子IFN-γ和IL-2浓度较前升高（1292.37±33.18 vs 1796.43±36.17 pg/ml,p＜0.001;20.66±1.71 vs 33.35±1.39 ng/ml,p=0.001）,而抑制免疫活性的细胞因子转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）和IL-10 浓度较前降低（1001.61±32.04 vs 700.84±18.94 pg/ml,p＜0.001;19.79±0.50 vs 13.63±0.40 ng/ml,p＜0.001）,差异有统计学意义,结果提示经过培养后,TIL细胞的免疫活性显著增强。（3）利用Online Kaplan-Meier Plotter数据库分析了 SOCS1的表达与肺腺癌患者的OS的关系。结果显示SOCS1高表达的患者,其OS（HR=1.55,95%CI:1.23-1.96,logrankp=0.00023）更差,SOCS1的表达与肺鳞癌的生存无显著相关性（HR=0.82;95%CI:0.65-1.04,logrank p=0.11）。（4）SOCS1在肺癌组织TIL表达量显著高于外周血T细胞,并且SOCS1高表达患者的Treg细胞比例显著高于SOCS1低表达患者（p＜0.001）。（5）构建SOCS1沉默稳定株,qPCR检测SOCS1 mRNA表达水平,Western blot检测SOCS1蛋白表达水平,结果显示各组均有绿色荧光,说明慢病毒感染成功,qPCR检测结果及Western blot检测说明2号干扰慢病毒的干扰效率最高（p＜0.001）。（6）流式检测沉默SOCS1对TIL细胞中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+T细胞比率的影响,结果显示沉默SOCS1后TIL细胞中CD3+、CD8+T细胞比率均有升高,而CD8+T细胞比率升高最为显著,由21.69%上升至51.11%,而CD4+、CD25+T细胞比例下降,差异有统计学意义,结果提示沉默SOCS1的TIL细胞免疫活性显著增强。（7）通过ELISA实验鉴定沉默SOCS1对TIL其上清中细胞因子的水平影响,结果显示,沉默SOCS1后可使促进免疫活性的细胞因子IL-2浓度较前升高（5.31±0.42 vs 3.60±0.12 ng/ml,p＜0.001）,而抑制免疫活性的细胞因子TGF-β浓度较前降低（787.41±48.93 vs 1207.34±46.70 pg/ml,p＜0.001）,差异有统计学意义。该结果提示沉默SOCS1的TIL细胞体液免疫活性进一步增强。（8）通过 CCK8 法检测沉默 SOCS1 的 TIL 对 H1299、SPC-A1 及 SK-MES-1 三株细胞系的杀伤能力,结果表明TIL细胞及沉默SOCS1的TIL细胞对三株细胞系均有一定的杀伤性,而沉默SOCS1的TIL杀伤肺癌细胞的能力较单纯TIL细胞强（p＜0.001）,其中沉默SOCS1的TIL对SPCA1细胞的杀伤能力最强（38.82±2.30%,p=0.006）,差异有统计学意义。结果提示沉默SOCS1的TIL对肺癌细胞株的杀伤作用增强。（9）通过CCK8法检测沉默SOCS1的TIL细胞联合Tim-3单抗对SPCA1细胞株的杀伤能力,结果表明在六个实验组中沉默SOCS1的TIL细胞联合Tim-3单抗对SPCA1细胞的杀伤能力最强（61.35±3.89%,p=0.001）,差异有统计学意义。（10）流式检测4个实验组,结果显示沉默SOCS1的TIL细胞联合Tim-3单抗组中CD3+CD8+T细胞比率较其他组高（p=0.001）,而CD4+CD25+T细胞比例最低（p＜0.001）,ELISA检测培养液上清结果显示沉默SOCS1的TIL细胞联合 Tim-3 单抗组中 IL-2 分泌量最高（10.17±0.32 vs 3.40±0.45 ng/ml,p＜0.001）,TGF-β分泌量最低（1790.03±58.44 vs 3209.32±151,33 pg/ml,p＜0.001）,差异有统计学意义。[结 论]（1）在人肺癌组织中可分离并提取出TIL细胞;通过体外活化增殖后的TIL较培养前其免疫活性被激活。（2）SOCS1在肺腺癌癌组织中高表达,SOCS1在肺腺癌中高表达提示肺癌患者预后更差。（3）SOCS1在肺癌组织TIL表达量显著高于外周血T细胞,并且SOCS1高表达患者的Treg细胞比例显著高于SOCS1低表达患者,提示SOCS1与Treg细胞介导的免疫负性调控作用密切相关。（4）慢病毒可成功转染TIL细胞,其中2号慢病毒转染效率最高,经过慢病毒转染后的TIL细胞其SOCS1表达降低。（5）沉默SOCS1的TIL不仅可以进一步增强其免疫活性,同时也可以增强其对NSCLC的杀瘤活性,说明通过沉默SOCS1能有效的解除肿瘤局部免疫抑制状态。（6）沉默SOCS1的TIL细胞联合Tim-3单抗可以通过重塑免疫微环境提高TIL的免疫活性及杀瘤活性。第三部分沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗提高小鼠肺癌移植瘤模型疗效的机制研究[结 果]（1）按分组对皮下移植瘤小鼠进行治疗,每三天治疗一次并测量瘤体大小计算瘤体体积,结果显示在治疗第6天开始沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗组瘤体体积显著小于空白对照组（p＜0.001）;治疗12天后脱颈椎处死小鼠,取出肿瘤组织,经过测量体积发现沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗组肿瘤体积显著小于其他组（p＜0.001）,结果提示沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗可以有效抑制肺癌细胞在小鼠体内的增殖。HE染色结果提示各组肿瘤组织均为癌组织。（2）取各实验组小鼠外周血,流式检测免疫细胞亚群比例,ELISA检测细胞因子分泌情况。结果显示在沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗组CD3+CD8+T细胞比例较其他组显著提高（p＜0.001）,而CD4+CD25+T细胞比例较其他组显著降低（p＜0.001）。细胞因子IL-2较其他组分泌升高（601.69±51.23 pg/ml,p＜0.001）,而细胞因子TGF-β较其他组分泌降低（353.45±40.51 pg/ml,p＜0.001）,差异有统计学意义。结果提示沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗可以有效解除小鼠肺癌模型整体免疫抑制状态。（3）取各实验组小鼠肿瘤组织,分离TIL细胞并流式检测免疫细胞亚群比例。结果显示在沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗组CD3+CD8+T细胞比例较其他组显著提高（p＜0.001）,而CD4+CD25+T细胞比例较其他组显著降低（p＜0.001）。结果提示沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗可以有效解除小鼠肺癌模型局部免疫抑制状态。[结 论]沉默SOCS1的TIL联合Tim-3单抗可以有效抑制肺癌细胞在小鼠体内的增殖,其主要机制是通过解除小鼠体内局部及整体免疫抑制并重塑免疫微环境提高TIL对肺癌细胞的杀伤作用。