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[目 的]心房颤动（Atrial fibrillation,AF）高发高危,由于发病机制尚不清晰,导致目前针对AF的治疗手段均存在技术复杂、费用昂贵、复发率高等重大问题。线粒体转录因子 A（Mitochondrial transcription factor A,TFAM）在心衰、心肌缺血中可作为保护因子延缓疾病进程,近年研究发现,TFAM在AF中也具有改善心肌细胞功能、增加细胞ATP含量的作用,但具体机制有待阐明。本研究从线粒体自噬出发,研究TFAM与线粒体自噬之间的作用关系,探索TFAM调控心肌纤维化的分子机制,为寻找AF新的治疗靶点提供理论依据。[方 法]第一部分:证明TFAM与AF心肌纤维化存在相关性1、收集AF患者与非AF患者右心房心肌组织样本,通过:（1）免疫组化技术检测两组患者心肌组织中TFAM的表达差异;（2）免疫荧光三重染色分析差异主要体现在心肌细胞还是心肌成纤维细胞。2、利用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导人心肌成纤维细胞纤维化,通过:（3）CCK-8细胞增殖实验摸索AngⅡ干预的时间;（4）Western blot检测对照组与模型组心肌成纤维细胞中TFAM、CollagenⅠ的表达变化。通过以上实验初步研究TFAM与AF及心肌纤维化的相关性。第二部分:验证TFAM是否调控线粒体自噬参与人心肌成纤维细胞纤维化,探索其分子机制体外培养人心肌成纤维细胞,利用慢病毒转染构建TFAM过表达/干扰细胞模型,Ang Ⅱ诱导细胞纤维化模型,根据以上处理,将细胞分为:空白对照组（NC）、纤维化模型组（NC+Ang Ⅱ）、TFAM过表达对照纤维化模型组（OE-NC+Ang Ⅱ）、TFAM 过表达纤维化模型组（OE-TFAM+Ang Ⅱ）、TFAM干扰对照纤维化模型组（shTFAM-NC+Ang Ⅱ）、TFAM干扰纤维化模型组（shTFAM+AngⅡ）,通过:（1）RT-PCR、Western blot验证TFAM过表达/干扰效果;（2）免疫荧光、Western blot检测以上不同组别中线粒体自噬的变化情况,验证TFAM与线粒体自噬的作用关系;（3）利用DCFH-DA荧光探针、Western blot检测在不同的TFAM 水平下活性氧（Reactive oxygen species,ROS）含量变化、NLRP3炎症小体激活情况、IL-1β和Collagen Ⅰ的表达情况。第三部分:探索TFAM是否通过Parkin调控线粒体自噬在TFAM过表达/干扰的人心肌成纤维细胞稳转株中转染Parkin小干扰RNA（si-Parkin）,根据以上处理,将细胞分为:TFAM干扰+Parkin沉默对照纤维化模型组（shTFAM+si-NC+Ang Ⅱ）、TFAM干扰+Parkin沉默纤维化模型组（shTFAM+si-Parkin+Ang Ⅱ）、TFAM过表达+Parkin沉默对照纤维化模型组（OE-TFAM+si-NC+Ang Ⅱ）、TFAM过表达+Parkin沉默纤维化模型组（OE-TFAM+si-Parkin+Ang Ⅱ）,通过:（1）RT-PCR、Western blot 验证 Parkin 沉默效果;（2）Western blot检测以上四个组别中TFAM与Parkin的表达变化,验证TFAM是否通过Parkin调控线粒体自噬。第四部分:验证TFAM是否通过Parkin调控线粒体自噬,并经由NLRP3/IL1β通路引起AF患者的心肌纤维化收集AF患者与非AF患者右心房心肌组织样本,利用:（1）Western blot、免疫荧光检测,比较以上两组患者心肌组织中TFAM与线粒体自噬的情况;（2）将新鲜的心肌组织样本制作成冰冻切片,通过ROS检测试剂盒检测AF组与非AF组ROS含量变化;（3）Western blot检测NLRP3炎症小体各组分及IL-1 β的表达水平;（4）Masson染色比较两组心肌纤维化的情况。[结 果]第一部分:TFAM与AF患者的心肌纤维化存在相关性（1）对比AF组与对照（非AF）组右心房心肌组织中TFAM蛋白的表达水平,发现:AF组心房肌组织中TFAM的表达水平低于非AF组,差异具有统计学意义;（2）免疫荧光三重染色显示:与对照组相比,AF组中TFAM+Vimentin的荧光共定位面积与Vimentin阳性面积比较低,差异具有统计学意义;而TFAM+α-Actinin的荧光共定位面积与α-Actinin阳性面积比在两组中没有明显差异;说明TFAM在两组中的表达差异主要是体现在心肌成纤维细胞;（3）空白对照组与Ang Ⅱ组细胞增值情况比较,在24h-72h这个时间段,随着时间的增长,细胞增殖速度逐渐加快,且AngⅡ组细胞的增殖速度明显高于对照组,差异具有统计学意义;（4）细胞经AngⅡ诱导后,TFAM的表达水平较对照组下降,而CollagenⅠ的表达水平则高于对照组,差异具有统计学意义。第二部分:TFAM调控线粒体自噬,抑制NLRP3炎症小体激活减轻人心肌成纤维细胞纤维化程度（1）慢病毒成功转染细胞,且RT-PCR和Western blot结果表明TFAM过表达有效,shTFAM-262、shTFAM-693、shTFAM-616 三个干扰慢病毒中,shTFAM-262的干扰效果在mRNA和蛋白水平都是最好的;（2）在人心肌成纤维细胞中过表达TFAM后,免疫荧光显示LAMP1和VDAC1荧光共定位阳性率增加,Western blot结果显示LC3、Parkin的表达水平升高,而TFAM干扰后则出现相反的结果,提示TFAM可促进线粒体自噬;（3）ROS的含量在TFAM过表达组明显降低,在TFAM干扰组则显著性升高,NLRP3炎症小体各组分、IL-1 β、Collagen Ⅰ的表达趋势一致,TFAM过表达组低于对照组,而TFAM干预组则高于对照组,差异具有统计学意义。第三部分:TFAM可通过Parkin调控线粒体自噬（1）siRNA 转染人心肌成纤维细胞,在 si-Parkin-293、si-Parkin-541、si-Parkin-899三个siRNA中,si-Parkin-293显示在mRNA水平有沉默效果,但蛋白水平沉默效果不明显,si-Parkin-541则表现出基因过表达的效果,si-Parkin-899在RT-PCR和Western blot实验中均有明显基因沉默的效果;（2）TFAM过表达后LC3表达水平升高,沉默Parkin后LC3水平明显下降,提示TFAM可通过Parkin调控细胞线粒体自噬。第四部分:TFAM可通过Parkin调控线粒体自噬、抑制NLRP3炎症小体激活、减少IL-1 β释放,降低患者心肌纤维化程度（1）AF患者与非AF患者右心房心肌组织中TFAM的表达与线粒体自噬水平成正相关;（2）AF患者心肌组织中ROS的含量显著性高于非AF患者,差异具有统计学意义;（3）NLRP3炎症小体各组分、IL-1 β的蛋白表达值均表现为AF组高于对照组,差异具有统计学意义;（4）Masson染色显示:AF患者心肌组织纤维化的程度重于非AF患者,差异具有统计学意义。[结 论]（1）TFAM在AF患者与非AF患者心房肌组织中的表达差异主要体现在心肌成纤维细胞中;（2）在人心肌成纤维细胞中过表达TFAM可通过Parkin途径增加线粒体自噬水平,并降低AngⅡ诱导后细胞ROS的含量、NLRP3炎症小体、IL-1 β及Collagen Ⅰ的表达量。（3）AF患者心房肌组织中TFAM表达水平较非AF患者显著降低,这可能导致细胞线粒体自噬减少、ROS蓄积、NLRP3炎症小体过度激活和IL-1 β生成增多,继而促进心肌纤维化,增加AF风险。