【摘 要】
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环境中的铜离子会富集于鱼类的肝脏,造成肝脏中铜过载,从而引发肝损伤,但目前还缺乏治疗鱼类肝损伤的有效策略。白介素-22（Interleukin-22,IL-22）主要作用于非免疫细胞,对哺乳动物肝损伤发挥正、负双向调控作用,但鱼类IL-22在肝损伤中的作用还未知。因此,本论文以草鱼为模型,拟在明确硫酸铜导致肝损伤基础上探讨IL-22对硫酸铜致肝损伤的修复作用及相关机制,主要内容如下:1.硫酸铜导致
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环境中的铜离子会富集于鱼类的肝脏,造成肝脏中铜过载,从而引发肝损伤,但目前还缺乏治疗鱼类肝损伤的有效策略。白介素-22（Interleukin-22,IL-22）主要作用于非免疫细胞,对哺乳动物肝损伤发挥正、负双向调控作用,但鱼类IL-22在肝损伤中的作用还未知。因此,本论文以草鱼为模型,拟在明确硫酸铜导致肝损伤基础上探讨IL-22对硫酸铜致肝损伤的修复作用及相关机制,主要内容如下:1.硫酸铜导致草鱼肝损伤及其机制探究。首先探究硫酸铜对草鱼毒性,经硫酸铜溶液（0.5-8.0 mg/L）浸泡处理体重20克左右的草鱼（Ctenopharyngodon idella）后,观察到:（1）鱼体出现体色偏黑、呼吸困难、全身颤抖等明显的中毒现象;（2）浓度低至0.5 mg/L的硫酸铜即可造成草鱼死亡,草鱼死亡率随硫酸铜浓度升高而增加。由于草鱼肝部是储存和代谢铜的主要场所,接着探究硫酸铜对于草鱼肝部的损伤作用。体内实验中,草鱼（20克）经硫酸铜溶液（1.5 mg/L）浸泡后,检测发现:（1）通过HE染色草鱼肝部组织切片显示肝部出现病理性改变;（2）血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平升高;（3）肝指数（肝脏重/草鱼体重）上调。进一步采用硫酸铜（0.3-30.0 mg/L）进行体外实验,结果显示:（1）MTT比色法实验发现硫酸铜抑制草鱼肝细胞系L8824细胞活力;（2）统计吖啶橙/溴乙锭（AO/EB）的染色结果,发现硫酸铜导致L8824细胞凋亡比例显著上调;（3）硫酸铜导致草鱼肝细胞系L8824的活性氧（ROS）水平上调,提示硫酸铜破坏细胞活性氧平衡,导致细胞氧化损伤,从而造成肝损伤;（4）硫酸铜上调L8824细胞中IL-22蛋白表达,提示IL-22可能参与硫酸铜致肝损伤过程。2.草鱼IL-22蛋白的重组表达和纯化。使用中国仓鼠卵巢细胞（CHO）真核表达系统,通过亲和层析纯化获得草鱼IL-22重组蛋白,并使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定其纯度,相应结果得到采用IL-22特异性抗体的免疫印迹实验（Western blot）的进一步验证。3.IL-22促进硫酸铜导致的肝损伤的修复及其机制的探究。体内实验中,草鱼经硫酸铜溶液（1.5 mg/L）浸泡并腹腔注射IL-22（每尾鱼5μg或10μg）后,检测发现:（1）HE染色实验显示IL-22能够恢复由硫酸铜导致的肝部病理性改变;（2）IL-22能够下调草鱼血清中硫酸铜刺激的ALT和AST水平;（3）IL-22能够改善由硫酸铜导致的草鱼肝指数异常。体外实验中,IL-22（100-1000 ng/m L）作用于硫酸铜处理的L8824细胞,检测结果显示:（1）IL-22能够改善硫酸铜抑制的细胞活力;（2）IL-22能够减少由硫酸铜介导凋亡的细胞比例;（3）IL-22能够抑制硫酸铜导致的ROS水平上调,提示IL-22能够调控细胞内ROS稳态,防止细胞受到氧化损伤。综上所述,本研究首次发现了硬骨鱼中IL-22对于硫酸铜导致肝损伤的修复作用,并初步阐明了相关机制,为防治草鱼肝损伤提供了新思路。
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